2 PrioCHECK™ FMDV NS Ab Strip Kit Notice d’Utilisation
Additif
Ramener le flacon d'additif (Composant 4) lyophilisé à 22±3°C et le
reconstituer avec 2.5 mL l'eau déminéralisée (Composant 5) fournie dans le
kit. Doit être conservé à −20°C jusqu’à la péremption.
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
1. Ramener les flacons à 22±3°C.
2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
3. Ouvrir le flacon soigneusement.
4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée (Composant 5) spécifiée.
5. Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat se dissoudre.
6. Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.
7. Laisser le flacon reposer au moins 15 minutes à 22±3°C avant utilisation.
8. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
Tampon ELISA
Ajouter l'additif au tampon de dilution pour obtenir une concentration
finale de 10% (v/v). Pour deux barrettes : préparer 4 mL (0.4 mL d'additif et
3.6 mL de tampon de dilution). Conserver le tampon ELISA non utilisé
à 5±3°C pendant 24 heures.
Conjugué
Préparer la dilution de travail du conjugué (Composant 2) en diluant le
conjugué dans le tampon ELISA. Pour 2 barrettes : préparer 2.1 mL de
conjugué dilué. (ajouter 70 µL de conjugué (30x) à 2.03 mL de tampon
ELISA).
Note : Le conjugué dilué doit être préparé juste avant utilisation.
Solution de lavage
Diluer le liquide de lavage (concentré 200x) (Composant 6) dans l'eau
déminéralisée. La quantité de liquide de lavage fournie est suffisante pour
préparer un volume final de 12 litres.
Stabilité du liquide de lavage dilué : 1 semaine à 22±3°C.
Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique
ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques
peut être fait manuellement avec au minimum 200 µL de liquide de lavage
par puits. Puis vider la plaque et répéter le lavage autant de fois que spécifié.
Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques sur du papier absorbant entre les
lavages. Tapoter fermement les plaques après le dernier cycle de lavage.
Incubation des sérums
Réaliser l’incubation du sérum en suivant le protocole de nuit ou le
protocole sur une journée. Les volumes requis des échantillons de test et de
contrôle diffèrent en fonction du protocole choisi.
Protocole d’incubation du sérum de nuit
1. Distribuer 80 µL de tampon ELISA dans tous les puits (Composant 1).
2. Déposer 20 µL de contrôle négatif (Composant 9) dans les puits A1 et B1.
3. Déposer 20 µL de contrôle positif faible (Composant 8) dans les puits
C1 et D1.
4. Déposer 20 µL de contrôle positif (Composant 7) dans les puits E1 et F1.
5. Déposer 20 µL d'échantillon dans les autres puits.
6. Couvrez la plaque de test avec le couvercle fourni.
7. Agiter doucement les plaques.
8. Incuber toute la nuit (16−18 heures) à 22±3°C.
Protocole d’incubation du sérum sur une journée
1. Distribuer 80 µL de tampon ELISA dans tous les puits (Composant 1).
2. Déposer 50 µL de contrôle négatif (Composant 9) dans les puits A1 et B1.
3. Déposer 50 µL de contrôle positif faible (Composant 8) dans les puits
C1 et D1.
4. Déposer 50 µL de contrôle positif (Composant 7) dans les puits E1 et F1.
5. Déposer 50 µL d'échantillon dans les autres puits.
6. Couvrez la plaque de test avec le couvercle fourni.
7. Agiter doucement les plaques.
8. Incuber 2 heures à 22±3°C.
Incubation avec le conjugue
Remarque : cette procédure doit se faire le deuxième jour en cas
d’utilisation du protocole d’incubation du sérum de nuit.
1. Vider la plaque de test après la période d’incubation du sérum, puis
laver la plaque 6 fois avec 200 à 300 µL de solution de lavage. Les
tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de
lavage.
2. Distribuer 100 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits.
3. Couvrez la plaque de test avec le couvercle fourni.
4. Incuber 60±5 minutes à 22±3°C.
Incubation avec le substrat chromogène (TMB)
1. Vider les plaques après incubation et laver 6 fois avec 200 à 300 µL la
solution de lavage. Les tapoter fermement sur du papier absorbant
après le dernier cycle de lavage.
2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) dans tous les puits.
3. Incuber 20 minutes à 22±3°C.
4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 11) dans tous les puits.
5. Homogénéiser le contenu des plaques avant de mesurer la densité
optique (DO).
Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 20 minutes après avoir
déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits.
Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre
et le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB).
Lecture du test et calcul des résultats
1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes
suivant l'addition de la solution d'arrêt.
2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 and B1 (contrôle négatif
= DO450 max).
3. Le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de contrôle et des
échantillons est calculé selon la formule ci-dessous.
La DO450 des échantillons est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par
rapport à la DO450 max.
PI = 100 − (DO450 de l'échantillon / DO450 max) × 100
Interprétation des résultats
Validation des critères
1. La DO450 max (DO450 moyenne du contrôle négatif) doit être >1.000.
2. Le pourcentage d'inhibition du contrôle positif faible doit être >50%.
3. Le pourcentage d'inhibition du contrôle positif doit être >70%.
Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont
ininterprétables.
Remarque : Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 max, le
pourcentage d'inhibition peut être considéré comme étant égal à 0%. Si la
DO450 moyenne du contrôle négatif (DO450 max) est inférieure à 1.000, la
solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au
moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de
substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les plaques plus longtemps
(sans dépasser 30 minutes d'incubation). Si la DO450 moyenne du contrôle
négatif (DO450 max) est supérieure à 2.000, il est conseillé de diminuer le
temps d'incubation avec le substrat chromogène (TMB).
Interprétation du pourcentage d'inhibition
PI = <50% Négatif
Absence d'anticorps spécifiques de la protéine NS du
virus de la fièvre aphteuse dans le prélèvement.
PI = ≥50% Positif
Présence d'anticorps spécifiques de la protéine NS du
virus de la fièvre aphteuse dans le prélèvement.
Références bibliographiques
Sørensen KJ, Madsen KG, Madsen ES, Salt JS, Nqindi J, Mackay DKJ (1998)
Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by
the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and
3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol
143:1461–1476.