Thermo Fisher Scientific VetMAX Swine Influenza A-09 Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Swine Influenza A-09 Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit

RT-PCR temps réel TaqMan® pour la détection du virus Influenza A

Référence INFAPSWINE

Partie Nº 100020376 Pub. Nº MAN0007808 Rév. B.0

Technique

Espèce(s)

Acides nucléiques isolés à partir des matrices

Test

RT-PCR temps réel (ARN)

– Duplex

– IPC Endogène

Porcins

Ecouvillons nasaux

Organes

Liquide broncho-alvéolaire

Liquide allantoïdien

Surnageant de culture cellulaire

Individuel

Ce kit est enregistré pour son utilisation en France par le Laboratoire National de Référence (LNR) Influenza Porcin (Anses, Ploufragan) et fait l’objet d’un

contrôle au lot par lot, réalisé par le LNR. Selon la recommandation du LNR, le réactif 4a - EPC Influenza A peut être remplacé par un témoin positif approprié

et calibré. Dans ce cas, la validation de la PCR repose sur la conformité du résultat pour les gènes de la cible et du contrôle interne, par rapport au résultat

attendu par le laboratoire pour ce témoin positif

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit est un outil de diagnostic moléculaire de l’Influenza de type A par la

technique de PCR en temps réel.

VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit permet la détection d’une région très conservée du gène M spécifique de tous les virus

Influenza A, dont la souche Influenza A/H1N1/2009 pandémique. Il ne détecte pas les autres souches Influenza (types B et C).

Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ARN viral de l’Influenza de type A et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC

traduit à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ARNs viraux extraits à partir d’écouvillons nasaux, d’organes, de liquide broncho-alvéolaire, de liquide

allantoïdien et de surnageant de culture cellulaire.

Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.

Réactifs du kit et conservation

VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant des réactifs pour la détection en duplex de

l’Influenza de type A et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. A la

première utilisation du kit, suivre les recommandations de conservation du tableau suivant pour chaque composant :

Composant Description Volume

(100 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

3 - Mix Influenza A

(Tube vert)

Mix pour RT-PCR TaqMan

. Il contient :

•Le système de détection pour la cible Influenza A : primers

forward et reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan® marquée

FAM™ - NFQ (NFQ = Non-Fluorescent Quencher).

•Le système de détection pour l’IPC : primers forward et

reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan® marquée VIC™ - TAMRA™.

•Le tampon, la reverse-transcriptase et l’enzyme de PCR.

2 × 1000 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

4c - EPC Influenza A

(Tube bleu)

External Positive Control :

Contrôle positif en Influenza A. Il s’agit d’un agent biologique

inactivé à extraire puis à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

2 × 200 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

2 VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit Notice d’Utilisation

Témoins d’extraction et d’amplification

VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’extraction et de l’amplification des ARN viraux :

4a - EPC Influenza A : contrôle positif en Influenza A

Contrôle positif à extraire en parallèle des échantillons lors de la première analyse.

Les ARNs extraits peuvent être conservés en dessous de −16°C pour les RT-PCR suivantes. Aliquoter ces ARNs extraits de façon à

limiter à 3 cycles de congélation/décongélation au maximum.

Un résultat positif avec une valeur conforme permet de valider l’amplification de la cible Influenza A par RT-PCR temps réel.

La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal

Positive Control), présent dans chaque échantillon. Un résultat IPC positif pour un échantillon permet de valider l’extraction de cet

échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des

inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (il peut être remplacé par le tampon utilisé

lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques puis RT-PCR temps réel. Un résultat négatif en Influenza A et en IPC permet de valider

le bon déroulement de l’extraction et l’absence de contamination durant cette phase du test.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL. Un résultat négatif pour toutes les cibles (Influenza A et IPC) permet de valider

l’absence de contamination au cours de la préparation de la RT-PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

•Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1,000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

•Eau DNase/RNase-free

•Tampon TE 1X

•Tampon PBS 1X

•Un thermocycleur de RT-PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

–FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

–VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm).

•Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé :

–Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits), microtubes ou capillaires

–Films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la RT-PCR temps réel est de 25 µL :

•3 - Mix Influenza A : 20 µL par analyse

•ARN extrait : 5 µL par analyse

Extraction des ARN viraux

Il est nécessaire d’isoler les ARNs à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.

NOTE: Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit, merci de

contacter le Support Technique.

Préparation de l’analyse

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible l’EPC des autres échantillons.

2. Décongeler le tube “3 - Mix Influenza A” entre +2°C et +8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser le tube “3 - Mix Influenza A” par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Distribuer 20 µL de “3 - Mix Influenza A” par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Ajouter les ARN des échantillons et contrôles à chaque mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ARN extraits de l’échantillon 5 µL

Contrôle positif d’amplification

ARN extraits de 4c - EPC Influenza A 5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS)

NCS extrait 5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free 5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

VetMAX™ Swine Influenza A-09 Kit Notice d’Utilisation 3

Amplification par RT-PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

INFA (Influenza A)

FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

IPC INFA

VIC™ TAMRA™(1)

Référence passive: ROX

™(1)

(1) Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.

Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur INFA et le détecteur IPC INFA dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1 ×1 45°C 10 minutes (10’00”)

Etape 2

×1 95°C 10 minutes (10’00”)

Etape 3 ×45 95°C 15 secondes (00’15”)

60°C(1) 45 secondes (00’45”)

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C - 45 secondes.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la RT-PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct des échantillons pour chaque détecteur selon les recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur “INFA” Détecteur “IPC INFA” Validation

EPC Influenza A

Ct = Ct QC INFA de “4c - EPC Influenza A” ± 3Ct(1) Ct < 45 ou Ct > 45(2) PCR validée

NCS

Ct > 45 Ct > 45 Extraction validée

Ct > 45 Ct > 45 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) La valeur d’IPC dans l’EPC n’est pas à prendre en compte pour la validation du test.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur “INFA”

Détecteur “IPC INFA” Interprétation

< 45

< 45 ou C

> 45

Influenza A détecté

> 45

Ct < 45 Influenza A non détecté

> 45

Ct > 45 Non validé(1)

(1) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ARN de l’échantillon non valide comme indiqué : dilution de l’ARN au 1:10 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ARN dilué est positif en Influenza A ou négatif en Influenza A avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.

4. Si l’ARN dilué est négatif en Influenza A avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non valide. Dans ce cas,

renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

14 juillet 2017

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique,

notamment :

•Numéros de téléphone partout dans le monde

•Commande et Support web

•Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

•Certificats d’analyse

•Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles

sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact

avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0007808 (français)

Révision

Date

Description

B.0

14 juillet 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0 Janvier 2014 Information sur l’enregistrement du kit par le Laboratoire National de Référence Influenza Porcin (Anses, Ploufragan)

Dilutions exprimées par « : »

1.0 Mai 2013 Nouveau document

Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de

diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.

TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.