Thermo Fisher Scientific VetMAX Schmallenberg Virus Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Schmallenberg Virus

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit

RT-PCR temps réel TaqMan™ pour la détection du SBV (Schmallenberg Virus)

Référence Catalogue SBVS50

Partie Nº 100020434 Pub. Nº MAN0007811 Rév. C.0

Technique

Espèce(s) Acides nucléiques isolés à partir des matrices Test

RT-PCR temps réel (ARN)

– Duplex

– IPC Endogène

Bovins

Petits ruminants

(ovins, caprins)

Tissu encéphalique

Sang (en tubes EDTA)

Sérum

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit est un outil de diagnostic moléculaire du virus SBV. Il permet la détection

spécifique du gène S du virus SBV par la technique de PCR en temps réel.

Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ARN viral du SBV et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois

l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ARNs viraux extraits à partir de tissu encéphalique, de sang (en tube EDTA) ou de sérum. La recherche du virus

est réalisée préférentiellement sur les encéphales des avortons, mais le virus peut également être localisé dans le sang (Source FLI –

Laboratoire National de Référence allemand). En l’absence d’informations complémentaires sur la durée de la virémie qui semble très

courte (2 à 3 jours) et sur la localisation du virus chez l’animal vivant, nous recommandons de travailler préférentiellement ARN viraux

extraits à partir de tissu encéphalique.

Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.

Réactifs du kit et conservation

VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant des réactifs pour la détection en duplex du SBV

et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. A la première utilisation du kit,

suivre les recommandations de conservation du tableau suivant pour chaque composant :

Nom Description Volume

(50 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

3 - Mix SBVS

(Tube vert)

Mix pour RT-PCR TaqMan™. Il contient :

• Le système de détection pour la cible SBV : primers

forward et reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan™ marquée

FAM™

NFQ

(NFQ = Non-Fluorescent Quencher).

• Le système de détection pour l’IPC : primers forward et

reverse, ainsi qu’une sonde TaqMan™ marquée

VIC™

TAMRA™.

•

Le tampon, la reverse transcriptase et l’enzyme de PCR.

2 × 500 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

4a - EPC SBVS

(Tube marron)

External Positive Control :

Contrôle positif en SBV. Il s’agit d’acides nucléiques déjà

extraits à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

90 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

2 VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit Notice d’Utilisation

Témoins d’extraction et d’amplification

Le VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ARN viraux :

4a - EPC SBVS : contrôle positif en SBV

Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible SBV par RT-PCR temps réel.

La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal

Positive Control), présent dans chaque échantillon.

Un résultat IPC positif pour un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le

pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques (avec ajout d’IPC) puis RT-PCR temps réel.

Un résultat négatif en SBV and en IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la PCR temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Un résultat négatif pour toutes les cibles (SBV et IPC) permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation de la

RT-PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

- FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

- VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),

microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :

• 3 - Mix SBVS : 20 µL par analyse

• ARN extrait : 5 µL par analyse

Extraction des ARN viraux

Il est nécessaire d’isoler les ARN à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit, merci de

contacter le Support Technique.

Préparation de la RT-PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres

échantillons.

2. Décongeler le tube 3 - Mix SBVS entre +2°C et +8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser le tube 3 - Mix SBVS par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix SBVS par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Ajouter les ARN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ARN extraits de l’échantillon 5 µL

Contrôle positif d’amplification 4a - EPC SBVS 5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS) NCS extrait 5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC) Eau DNase/RNase-free 5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

VetMAX™ Schmallenberg Virus Kit Notice d’Utilisation 3

Amplification par PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

SBV FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

IPC CAS VIC™ TAMRA™(1)

Référence passive : ROX

™(1)

(1) Les fluorophores ROX™ et TAMRA™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.

Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par RT-PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon les détecteurs SBV et le détecteur IPC SBV dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Table 1 Méthode standard (à utiliser avec les échantillons purifiés à l’aide d’un script standard sur un instrument KingFisher™)

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1 ×1 45°C 10 minutes

Etape 2

×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×40 95°C 15 secondes

60°C(1) 45 secondes

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 45 secondes

Table 2 Méthode express (à utiliser avec les échantillons purifiés à l’aide d’un script express sur un instrument KingFisher™)

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1 ×1 48°C 5 minutes

Etape 2

×1 97°C 5 minutes

Etape 3 ×40 97°C 2 secondes

60°C(1) 35 secondes

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 35 secondes

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les

recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur SBV Détecteur IPC SBV Validation

EPC SBVS

Ct = Ct QC SBV de 4a - EPC SBV ± 3Ct(1) Ct < 40 ou Ct > 40(2) PCR validée

NCS

Ct > 40 Ct < 40 Extraction validée

Ct > 40 Ct > 40 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées pour “EPC” dans le Certificat d’analyse du lot utilisé pour le test.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur SBV

Détecteur IPC SBV Interprétation

Ct < 40 Ct < 40 ou Ct > 40 SBV détecté

> 40

Ct < 40 SBV non détecté

> 40

Ct > 40 Non validé(1)

(1) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

18 décembre 2020

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ARN de l’échantillon non validé au 1:5 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ARN dilué est positif en SBV ou négatif en SBV avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.

4. Si l’ARN dilué est négatif en SBV avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non valide. Dans ce cas,

renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:2 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur

thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux

dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance

technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également

appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque: Pour les FDS relatives aux réactifs et aux

produits chimiques d'autres fabricants, contacter

chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs

produits selon les termes et conditions générales de ventes

disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home

/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions,

vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à

l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

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RÉSULTANT.

Historique des révisions pour Pub. N° MAN0007811 (français)

Révision

Date

Description

C.0

18 décembre 2020

Mise à jour pour inclure un nouveau protocole thermique express et modifier le nombre de cycles du protocole standard.

B.0

9 mars 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

Novembre 2015

Modification des matrices

2.0

Juin 2013

Correction des marques de commerce

1.0

Avril 2013

Nouveau document

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