3M Allergen Protein ELISA Kit Mode d'emploi

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Date de parution: 2017-11

Instructions relatives au produit

Kit ELISA Protéine Noix de Coco

Méthode immuno-enzymatique (ELISA) destinée à l’analyse quantitative des protéines de noix de coco.

Description et utilisation du produit

Le Kit ELISA 3M™ Protéine Noix de Coco est conçu pour détecter des protéines de noix de coco dans l’eau de rinçage

nal d'un processus de nettoyage (PN), des échantillons d’écouvillons environnementaux, dans des ingrédients

alimentaires et dans des produits alimentaires transformés.

Le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco utilise un test ELISA en sandwich. Les protéines de noix de coco présentes dans

l’échantillon réagissent avec les anticorps anti-noix de coco qui ont été adsorbés à la surface des puits de microtitration

en polystyrène. Après élimination par lavage des protéines non xées, on ajoute des anticorps anti-noix de coco couplés

à la peroxydase de raifort (HRP). Ces anticorps marqués par l’enzyme forment des complexes avec la protéine de noix de

coco qui s’est xée dans l’étape précédente. Suite à une seconde étape de lavage, l’enzyme liée à l’immuno-adsorbant est

détectée en lui ajoutant un substrat chromogène, la 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB). L’apparition de la couleur issue

de cette réaction enzymatique varie en fonction directe de la concentration de protéine de noix de coco dans l’échantillon

testé; par conséquent, l’absorbance à 450nm représente une mesure de la concentration de protéine de noix de coco

dans l’échantillon testé. La quantité de protéine de noix de coco contenue dans l’échantillon testé peut être extrapolée à

partir de la courbe étalon, obtenue à partir de solutions étalons de concentration connue, puis ajustée pour tenir compte de

la dilution de l’échantillon.

Le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco est conçu pour être utilisé en laboratoire, par des professionnels formés

aux techniques de laboratoire. 3M n’a pas étudié l’utilisation de ce produit dans des secteurs autres que ceux de

l’alimentaire et des boissons. Par exemple, 3M n’a pas étudié ce produit dans le cadre de tests sur des échantillons de

produits pharmaceutiques, cosmétiques, cliniques ou vétérinaires. Le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco n’a pas été

évalué avec tous les produits, processus alimentaires et protocoles de tests possibles.

Le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco contient 96puits, décrits dans le Tableau1.

Tableau1. Contenu du kit

Élément Identication Préparation

(voir la section

Préparation des

réactifs pour plus de

détails)

Stockage Stabilité

Puits ELISA 3M™

Protéine de Noix de

coco

Un sachet hermétique

contenant une plaque de

96puits amovibles recouverts

d’anticorps.

Prêts à l’emploi. 2 à 8°C dans

le sachet

scellé avec

un agent

dessiccateur.

Refermer

hermétiquement le

sachet contenant

les puits non utilisés

et le dessiccateur.

Conserver entre

2 et 8°C pour

maintenir la stabilité

jusqu’à la date de

péremption du kit.

Conjugué HRP 3M™

Noix de coco (10X)

Une ampoule avec 1,5mL

d’anticorps couplés à la

peroxydase de raifort (HRP)

10X (10X).

Diluer à 1/10 juste

avant utilisation pour

obtenir une solution

de travail 1X.

2 à 8°C à

l’obscurité.

Le conjugué 10X est

stable jusqu’à la date

de péremption du kit.

3

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2

Étalon concentré

3M™ Protéine Noix

de coco

Une ampoule de solution de

protéine de noix de coco de

concentration connue.

Se référer à la

section Procédure

du test ELISA pour

la préparation de la

solution étalon.

2 à 8°C. Ne

pas congeler.

L’Étalon concentré

3M Protéine Noix

de coco est stable

jusqu’à la date de

péremption du kit.

Diluant 3M™ (5X) Un acon de 50mL de

Diluant 5X.

Diluer à 1/5 juste

avant utilisation pour

obtenir une solution

de travail 1X.

2-8°C La Solution de diluant

3M 5X est stable

jusqu’à la date de

péremption du kit.

Solution de lavage

3M™ (20X)

Un acon de 50mL de

solution de lavage 20X.

Diluer à 1/20 pour

obtenir une solution

de travail 1X.

2 à 8°C aussi

bien pour

la solution

de travail 1X

que pour le

concentré de

Solution de

lavage 20X.

La Solution de lavage

3M 20X est stable

jusqu’à la date de

péremption du kit. La

Solution de lavage 1X

est stable pendant au

moins une semaine

après préparation.

Tampon d’extraction

3M™ E26 (4X)

Un acon de 120mL de

tampon d’extraction 4X.

Diluer à 1/4 pour

obtenir une solution

de travail 1X. La

solution de travail

doit être chauée

à 50 à 60°C avant

utilisation.

2 à 8°C aussi

bien pour

la solution

de travail 1X

que pour le

concentré

de Tampon

d’extraction

3M 4X.

Le Tampon

d’extraction 1X et le

Tampon d’extraction

3M 4X sont stables

jusqu’à la date de

péremption du kit.

Solution de substrat

chromogène 3M™

Un acon de 12mL de

3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine

(TMB).

Prêts à l’emploi. 2 à 8°C à

l’obscurité.

Protéger de la

lumière. La Solution

de substrat

chromogène 3M est

stable jusqu’à la date

de péremption du kit.

Solution d’arrêt 3M™ Un acon de 12mL d’acide

sulfurique à 0,3M.

Prêts à l’emploi. 2-8°C La Solution d’arrêt

3M est stable jusqu’à

la date de péremption

du kit.

Accessoires non inclus dans le kit:

• Pipettes de précision et leurs embouts pour pipetter de 10 à 100L

• Éprouvettes

• Laveur/aspirateur pour plaque de microtitration

• Eau distillée ou désionisée

• Lecteur de test de microtitration

• Divers ustensiles de laboratoire pour la préparation des solutions de réactifs et de tampon

• Minuteur

• Vortex

• Bain-marie à agitation ou agitateur incubateur

• Agitateur orbital

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Consignes de sécurité

L’utilisateur doit lire attentivement, comprendre et respecter toutes les consignes de sécurité fournies dans les instructions

relatives au Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco. Conserver ces consignes de sécurité pour s'y référer ultérieurement.

AVERTISSEMENT: indique une situation dangereuse qui, si elle n'est pas évitée, pourrait entraîner un décès, des

blessures graves et/ou des dommages matériels.

REMARQUE: indique une situation potentiellement dangereuse qui, si elle n’est pas évitée, pourrait entraîner

des dommages matériels.

W AVERTISSEMENT

Pour réduire les risques associés à l’exposition à des produits chimiques:

• Mettre au rebut conformément aux normes et réglementations locales/régionales/nationales/du secteur.

• L’utilisateur doit former son personnel aux techniques correctes de test; par exemple aux Bonnes pratiques de

laboratoire

1

ou à la norme ISO/CEI17025

2

.

• Toujours se conformer aux pratiques de sécurité standards en laboratoire, notamment le port d’un équipement de

protection adéquat et de lunettes de protection pour manipuler les réactifs.

• Éviter le contact de la Solution d’arrêt 3M avec la peau, voir la Fiche de données de sécurité pour davantage

d’informations sur la sécurité.

Pour réduire les risques associés aux résultats faux négatifs, qui peuvent entraîner la diusion de produits contaminés :

• Conserver le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco conformément aux indications fournies sur l’emballage et dans

les instructions relatives au produit.

• Utiliser le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco pour les échantillons alimentaires et environnementaux qui ont été

validés en interne ou par une tierce partie.

• Se conformer au protocole et eectuer les tests en suivant exactement les instructions relatives au produit.

• 3M n’a pas étudié l’utilisation du Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco dans des secteurs autres que ceux de

l’alimentaire et des boissons. Par exemple, 3M n’a pas étudié ce produit dans le cadre de tests sur des échantillons

de produits pharmaceutiques, cosmétiques, cliniques ou vétérinaires.

Pour réduire les risques liés aux résultats inexacts, qui peuvent entraîner la diusion de produits contaminés:

• Toujours utiliser le Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco avant sa date de péremption.

• Toujours préparer les solutions de travail en utilisant les réactifs concentrés du Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco

portés à une température de 20 à 25°C.

• Ne pas congeler l’Étalon concentré 3M Protéine de Noix de coco.

• Si la Solution de substrat chromogène bleuit, ne pas l’utiliser. Conformez-vous aux Bonnes pratiques de laboratoire

1

pour éviter la contamination croisée par la Solution de substrat chromogène 3M.

REMARQUE

Pour réduire les risques découlant de faux résultats:

• La stabilité des échantillons suite à leur extraction n’a pas été évaluée. La procédure ELISA doit être mise en œuvre

juste après l’extraction des échantillons.

• Manipuler les Étalons 3M Protéine de Noix de coco en respectant les Bonnes pratiques de laboratoire

1

pour éviter

la contamination croisée des échantillons.

Consulter la che de données de sécurité du produit pour plus de renseignements.

Pour obtenir une documentation sur la performance de ce produit, veuillez consulter notre site Internet

www.3M.com/foodsafety ou contacter un représentant ou distributeur 3M local.

Responsabilité de l’utilisateur

Il incombe aux utilisateurs de connaître les instructions et les informations relatives au produit. Rendez-vous sur notre

site www.3M.com/foodsafety ou contactez votre représentant ou distributeur3M local pour obtenir de plus amples

informations.

Comme pour toutes les autres méthodes de test utilisées à des ns d'analyses alimentaires, la matrice analysée peut

inuer sur les résultats. Lors du choix d'une méthode de test, il est important d'admettre que des facteurs externes comme

les méthodes d'échantillonnage, les protocoles de test, la préparation des échantillons, la manipulation et les techniques de

laboratoires peuvent inuencer les résultats. L'échantillon alimentaire en tant que tel peut inuer sur les résultats.

Il est de la responsabilité de l'utilisateur de choisir une méthode de test ou un produit pour évaluer un nombre susant

d'échantillons an de s'assurer que la méthode de test choisie répond à ses critères.

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Il incombe également à l’utilisateur de déterminer si une méthode d’analyse et ses résultats répondent aux exigences de

ses clients ou fournisseurs.

Comme pour toute méthode d’analyse, les résultats obtenus avec un produit3M Sécurité Alimentaire ne constituent pas

une garantie de la qualité des matrices ou des processus testés.

Limitation de garantie/Limites de recours

SAUF SI EXPRESSÉMENT ÉTABLI DANS LA SECTION DE GARANTIE LIMITÉE D'UN EMBALLAGE DE PRODUIT

INDIVIDUEL, 3M RENONCE À TOUTE GARANTIE EXPLICITE ET IMPLICITE, Y COMPRIS, MAIS SANS S'Y LIMITER,

TOUTE GARANTIE DE COMMERCIALISATION OU D'ADAPTATION POUR UN USAGE SPÉCIFIQUE. En cas de

défaut de tout produit 3M Sécurité Alimentaire, 3M ou son distributeur agréé s'engage, à son entière discrétion, au

remplacement ou au remboursement du prix d'achat du produit. Il s'agit de vos recours exclusifs. Tout défaut supposé

du produit devra être notié à 3M dans un délai de soixante jours et le produit renvoyé au fournisseur. Veuillez appeler

le Service clientèle (1-800-328-1671 aux États-Unis) ou votre représentant ociel 3M Sécurité Alimentaire pour obtenir

une autorisation de renvoi.

Limitation de responsabilité de 3M

3M NE SERA PAS TENUE RESPONSABLE DES PERTES OU DES DOMMAGES ÉVENTUELS, QU'ILS SOIENT DIRECTS,

INDIRECTS, SPÉCIFIQUES, ACCIDENTELS OU CONSÉCUTIFS, Y COMPRIS, MAIS SANS S'Y LIMITER, LES PERTES

DE PROFITS. En aucun cas et en aucune manière, la responsabilité de 3M ne sera engagée au-delà du prix d'achat du

produit prétendu défectueux.

Conservation et élimination des déchets

Conserver le contenu du Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco à 2 à 8°C. Ne pas congeler. Conserver les solutions de

travail comme décrit dans le Tableau1.

Le contenu du Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco ne doit pas être utilisé au-delà de sa date de péremption. La date de

péremption et le numéro de lot sont inscrits sur l’étiquette à l'extérieur de la boîte.

Mettre au rebut conformément aux normes et réglementations locales/régionales/nationales/du secteur.

Instructions d’utilisation

Suivre attentivement toutes les instructions. Dans le cas contraire, les résultats obtenus risquent d'être inexacts.

Préparation des réactifs

Porter tous les réactifs à température ambiante (20 à 25°C) avant de les utiliser. Utiliser des ustensiles de laboratoire

propres pour diluer et conserver les solutions de travail.

a. Tampon d’extraction 3M

Pour préparer le Tampon d’extraction 1X, verser un volume de Tampon d’extraction 3M (4X) et le diluer dans trois

volumes d’eau distillée ou désionisée. Avant utilisation, préchauer le Tampon d’extraction (1X) à 50 à 60°C à l’aide

d’un bain-marie ou d’un agitateur incubateur. Chaque échantillon nécessite 4,5mL de Tampon d’extraction 1X.

b. Solution de diluant 3M

Pour préparer la solution de Diluant 1X, verser un volume de Diluant 3M (5X) dans quatre volumes d’eau distillée ou

désionisée. Chaque échantillon nécessite au total 4,5mL de solution de Diluant 1X.

c. Solution de lavage 3M

Pour préparer la Solution de lavage 1X, verser un volume de Solution de lavage 3M (20X) dans 19 volumes d’eau

distillée ou désionisée. Chaque Puits ELISA 3M nécessite environ 2,5mL de Solution de lavage 1X.

Remarque: il peut se former des cristaux dans la Solution de lavage 3M (20X) lorsqu’elle est conservée à 2 à 8°C.

Pour dissoudre les cristaux, porter la Solution de lavage 3M (20X) à 30 à 35°C au bain-marie ou dans un incubateur

avant de préparer la Solution de lavage (1X).

d. Conjugué HRP 3M Noix de coco

Pour préparer le Conjugué HRP Noix de coco 1X, verser un volume de Conjugué HRP 3M Noix de coco (10X) et le

diluer dans 9volumes de solution de Diluant 1X. Préparer juste avant utilisation. Chaque Puits ELISA 3M nécessite

100L de Conjugué HRP Noix de coco 1X.

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Préparation de l'échantillon

Remarque: tous les échantillons doivent être extraits à l’aide du Tampon d’extraction 1X préchaué à 50 à 60°C.

1.1 Préparer l’échantillon pour l’extraction des protéines, dans une éprouvette propre ou un tube jetable, comme décrit

dans le Tableau 2.

Tableau2. Préparation de l'échantillon

Matrice de l’échantillon Taille de

l’échantillon

Dilution (1/10)

Aliments solides 0,5 ± 0,02 g Verser 4,5 ± 0,09mL de Tampon d’extraction 1X

préchaué

Aliments liquides 0,5 ± 0,01mL Verser 4,5 ± 0,09mL de Tampon d’extraction 1X

préchaué

Eau de rinçage nal d'un processus de

nettoyage (PN)

0,5 ± 0,01mL Verser 4,5 ± 0,09mL de Tampon d’extraction 1X

préchaué

Solide

Liquide

1.2 Incuber les échantillons dilués à 50 à 60°C, dans un bain-marie ou un incubateur avec agitation, pendant

25 ± 1minutes. Il est également possible de laisser les échantillons dans un bain-marie ou un incubateur à

50 à 60°C et de les agiter manuellement pendant 1minute toutes les 5minutes.

1.3 Après incubation, centrifuger les échantillons à 5000-7000tr/min (3000 x g) pendant 20 à 30secondes pour

éliminer les particules ou les laisser reposer pendant 5minutes dans un support pour éprouvettes.

1.4 Prélever 100L de phase aqueuse au milieu du tube et les ajouter à 900L de Solution de diluant (1X). Passer au

vortex ou agiter pour bien mélanger. (Cette solution correspond à une dilution à 1/100 de l’échantillon de départ.)

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ou

50-60°C

00:25:00

ou

3000g / 00:00:30

00:05:00

Procédure du test ELISA

2.1 Prélever un Puits ELISA 3M par échantillon et/ou étalon et placer les puits dans le support à micropuits. Remettre

les Puits ELISA 3M non utilisés dans le sachet, le refermer hermétiquement et le conserver à nouveau à 2 à 8°C.

2.2 En utilisant l’Étalon concentré 3M Protéine de Noix de coco, préparer une série de quatre solutions étalons, diluées dans

la Solution de diluant (1X).

Numéro de

l’étalon

Concentration de l’étalon

(ng/mL)

Volume d’étalon ajouté au

Diluant 1X

Volume de solution de

Diluant 1X

4 540 10L d’Étalon concentré 3M

Protéine de Noix de coco

990L

3 180 200L d’étalon n°4 400L

2 60 200L d’étalon n°3 400L

1 20 200L d’étalon n°2 400L

0 0 0 400L

2.3 Pipetter 100L de chaque solution étalon dans des Puits ELISA 3M.

• Étalon 0 (Solution de diluant 1X)

• Étalon 1 (20 ng/mL) ppb

• Étalon 2 (60 ng/mL) ppb

• Étalon 3 (180 ng/mL) ppb

• Étalon 4 (540 ng/mL) ppb

2.4 Pipetter 100 L de l’échantillon extrait préparé à l’étape 1.4 dans un Puits ELISA 3M .

2.5 Incuber les Puits ELISA 3M dans un agitateur orbital réglé sur 400tr/min à température ambiante (20 à 25°C)

pendant 30 ± 2minutes. Pendant cette étape, maintenir les puits couverts et à niveau pour prévenir l’évaporation.

2.6 Après incubation, aspirer le contenu des Puits ELISA 3M.

2.7 Remplir complètement chaque Puits ELISA 3M avec la Solution de lavage 1X et aspirer. Si le lavage est eectué

manuellement, retourner la plaque, verser/secouer le contenu des puits au-dessus d’un contenant pour déchets et

tapoter fermement les puits sur du papier absorbant pour enlever les résidus de solution de lavage. Répéter cette

étape trois fois pour un total de quatre lavages.

(Français)

FR

7

2.8 Pipetter 100L de Conjugué HRP Noix de coco 1X dans chaque Puits ELISA 3M. Incuber dans un agitateur

orbital réglé sur 400tr/min, à température ambiante, pendant 10 ± 2minutes. Maintenir la plaque couverte, dans

l’obscurité et à niveau pendant cette étape.

2.9 Répéter les étapes 2.6 et 2.7 pour eectuer au total quatre lavages avec la Solution de lavage (1X).

2.10 Pipetter 100 L de Solution de substrat chromogène 3M dans chaque Puits ELISA 3M.

2.11 Incuber dans un agitateur orbital réglé sur 400tr/min, à température ambiante, pendant 10 minutes. Maintenir la

plaque couverte, dans l’obscurité et à niveau pendant cette étape.

2.12 Après incubation, verser 100L de Solution d’arrêt 3M dans chaque Puits ELISA 3M et déterminer l’absorbance

(à 450nm) dans un délai de 30minutes.

00:30:00/température ambiante

00:10:00/température ambiante

(Français)

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Analyse des résultats

3.1 Soustraire la valeur de fond moyenne pour chaque échantillon (la mesure d’absorbance moyenne de l’échantillon

moins la mesure d’absorbance moyenne de l’étalon zéro).

3.2 À l’aide d’un logiciel informatique capable de générer un modèle d’ajustement logistique à quatre paramètres,

construire une courbe étalon en plaçant la concentration en ng/mL (ppb) sur l’axe des abscisses et la mesure

d’absorbance sur l’axe des ordonnées. Une fonction polynôme du second degré (quadratique) ou d’autres modèles

d’ajustement de courbes peuvent être utilisés; cependant, ils donneront un ajustement des données moins précis.

3.3 Calculer les concentrations des échantillons à l’aide de la courbe étalon; l’unité des résultats est le ng/mL (ppb).

Puis, multiplier par le facteur de dilution de l’échantillon pour obtenir la concentration de l’échantillon de départ.

Par exemple, si la dilution totale de l’échantillon est de 1/100, et que la concentration de l’échantillon, donnée par la

courbe étalon, est de 200ng/mL (ppb), la concentration nale de l’échantillon est200ng/mL x 100 = 20000ng/mL

(ppb), soit 20g/mL (ppm).

Caractéristiques des performances minimales

a. La Limite de détection (LOD) analytique est de 9,7ng/mL (ppb)

La limite de détection est dénie comme la plus faible concentration d’allergène présente dans un échantillon testé

qui peut être distinguée d’un échantillon blanc véritable, à un niveau de probabilité spécié

3

. Elle est déterminée

en ajoutant trois déviations standards à la valeur moyenne de densité optique de 48 répliques zéro standards et en

calculant la concentration correspondante.

b. La limite de quantication (LOQ) est de 2 ppm

La limite de quantication est dénie comme la plus faible concentration d’allergène présente dans un échantillon

testé qui peut être raisonnablement quantiée, à un niveau de précision spécié

3

.

Précision

Précision intra-test %CV moyen = <10% N=12

Précision inter-test %CV moyen = <10% N=12

Spécicité et réactivité croisée

Ce test, qui détecte les protéines de noix de coco, a été testé sur divers échantillons pour analyser la réactivité croisée

(Tableau3).

Tableau3. Réactivité croisée du Kit ELISA 3M Protéine Noix de Coco.

Matrice d’échantillons % réactivité croisée

Farine d’amande <1%

Lait d’amande <1%

BLG <1%

Caséine bovine <1%

Lait de vache <1%

Noix du Brésil <1%

Farine de sarrasin <1%

Noix de cajou <1%

Céleri <1%

Pois chiche <1%

Farine de noix de coco (+)

Lait de noix de coco (+)

Farine de maïs <1%

Parvalbumine de poisson <1%

Noisette <1%

Haricot de Lima <1%

Noix de macadamia <1%

Graine de moutarde <1%

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