Thermo Fisher Scientific PrioCHECK PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: PrioCHECK PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit

Test ELISA pour la détection

in vitro

des anticorps spécifiques de la glycoprotéine E (gE) du virus de la maladie d'Aujeszky

(pseudorage) dans le sérum de porcs

Référence Catalogue 7589010

Pub. Nº MAN0013820 Rév. A.0

AVERTISSEMENT !

Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des

gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS.

Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit

disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Introduction

Le Virus de la maladie d'Aujeszky (MA) ou pseudorage, est un herpèsvirus responsable d'une infection virale largement répandue dans le monde, qui touche

principalement le porc, entraînant des pertes économiques importantes au niveau de l'industrie porcine. Les manifestations cliniques sont variées: atteintes du

système nerveux, du système respiratoire, troubles de la reproduction, mort de l'animal. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit

détecte dans le sérum de porcs infectés, les anticorps dirigés contre la glycoprotéine E (gE) du virus de la MA, mais ne détecte pas les anticorps spécifiques

chez les porcs vaccinés avec un vaccin marqueur de la MA (délété en gE). La présence d'anticorps spécifiques de la gE peut indiquer une exposition au vaccin

conventionnel fabriqué avec l'antigène gE et/ou une infection naturelle par différents types de virus.

PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit permet de différencier les porcs infectés des porcs vaccinés, uniquement si les porcs ont été vaccinés avec des

virus n'exprimant pas la gE. Ce test rend possible la réalisation d'enquêtes séro-épizootiologiques pour détecter la MA à l'échelle individuelle et à l'échelle du

troupeau, dans les populations de porcs vaccinés. Ainsi, l'utilisation conjointe du PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit et de la vaccination avec le

vaccin délété en gE, pourrait constituer la base de programmes combinés de vaccination et d'éradication du virus de la maladie d'Aujeszky (pseudorage). En

plus de son utilisation pour différencier les porcs infectés des porcs vaccinés, PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit permet aussi de détecter les

animaux infectés dans un troupeau non vacciné.

Principe du test

PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit est un ELISA bloquant. La liaison entre un épitope de la glycoprotéine E (gE) de la MA et un anticorps

monoclonal spécifique de la MA, est bloquée par les anticorps spécifiques présents dans l'échantillon. La microplaque est coatée avec un antigène non

infectieux du virus de la MA. Le tampon ELISA et les sérums non dilués de porcs sont déposés dans les puits (la dilution finale des sérums est au 1 :2). La

plaque est incubée 1 heure à 37±1°C ou toute la nuit à 5±3°C. Aprés lavage de la plaque, le conjugué, formé d'un anticorps monoclonal lié à la péroxydase

de raifort (HRPO) est ajouté et la plaque est incubée à nouveau 1 heure à 37±1°C. La plaque est ensuite lavée et le substrat chromogène est ajouté. Le

développement de la coloration est stoppé au bout de 20 minutes, par addition de la solution d'arrêt, et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm.

Le coffret contient aussi un sérum de contrôle prêt à l'emploi servant à valider la lecture cinétique. Ce sérum de contrôle positif faible permet à

l'utilisateur :

• D'évaluer à quel moment la densité optique (DO) des puits peut-être lue par le PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit.

• De faire une lecture cinétique, en laissant la coloration se développer davantage et en mesurant la densité optique à 650 nm après avoir sélectionné

cette option du logiciel.

Composition du coffret

Coffret de 5 plaques pour 450 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C

jusqu’à la date d'expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée

de conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou

reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous).

Composant

Description

1 : Microplaque

Cinq microplaques de barrettes sécables

emballées individuellement avec un

dessiccant .

2 : Conjugué (30x)

Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un

flacon contenant 2.5 mL de conjugué. Le

conjugué dilué n’est pas stable, à préparer

juste avant utilisation.

3 : Tampon de dilution (2x)

Concentré 2x, à diluer avant utilisation. Un

flacon contenant 60 mL de tampon de

dilution. Conservation du ELISA tampon de

dilution supérieur à 4 heures à 22±3°C.

4 : Liquide de lavage (200x)

Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un

flacon contenant 60 mL de solution de lavage.

Conservation de la solution: 1 semaine à

22±3°C.

5 : Sérum de contrôle

négatif

Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL

de sérum de contrôle négatif (vert).

6 : Sérum de contrôle

servant à valider la lecture

cinétique

Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL

de sérum de contrôle pour la validation de la

lecture cinétique (orange).

7 : Sérum de contrôle positif

Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 1.5 mL

de sérum de contrôle positif (rouge).

8 : Substrat chromogène

(TMB)

Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de

substrat chromogène (TMB).

9 : Solution d'arrêt

Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de

solution d'arrêt.

Autres composants du

coffret

• Notice d'utilisation

•

10 films adhésifs pour couvrir les plaques

Equipement nécessaire mais non fourni

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur

thermofisher.com.

Use

Description

Général

Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales.

Incubation

Incubateur de microplaque (chauffant au moins à 50°C).

Analyse des

résultats

Lecteur de microplaques : Multiskan EX ou équivalent. Le

lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire les

plaques à 450 nm.

Optionnel

Laveur de microplaques : Tecan EIA Tray Washer ou équivalent.

Mode opératoire

Précautions

• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon

stricte.

• Le PrioCHECK™ PRV gE 2.0 Antibody ELISA Kit ne doit être réalisé

que dans les laboratoires équipés pour cela.

• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement

infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être

considéré comme potentiellement contaminé.

Remarques

Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ PRV gE 2.0

Antibody ELISA Kit, les précautions suivantes doivent être prises :

• Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi.

• Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante

(22±3°C) avant utilisation.

• L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel

échantillon ou réactif est prélevé.

• Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif.

• Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de

péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.

• Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots

différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.

• Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

30 avril 2019

Solutions à préparer à l'avance

Tampon ELISA

Le tampon de dilution (Composant 3) doit être dilué au 1:2 dans de l'eau

déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer un volume final de

120 mL. Peut être conserve plus de 4 heures à 22±3°C.

Dilution du conjugué

Préparer la dilution de travail du conjugué (30x) (Composant 2) dans du

tampon ELISA. Pour une plaque : préparer 12 mL (ajouter 0.4 mL de

conjugué (30x) concentré à 11.6 mL de tampon ELISA).

Remarque : La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste

avant utilisation.

Solution de lavage

La solution de lavage (200x) (Composant 4) concentrée doit être diluée

dans de 1:200 l'eau déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer

un volume final de 12 litres.

Stabilité de la solution de lavage diluée : 1 semaine à 22±3°C.

Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique

ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques

peut être fait manuellement avec 200 à 300 µL de solution de lavage par

puits. Vider ensuite les plaques et répéter le lavage autant de fois que

spécifié. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques sur du papier

absorbant entre les lavages. Les tapoter fermement sur du papier

absorbant après le dernier cycle de lavage.

Incubation des sérums

1. Distribuer 50 µL de tampon ELISA dans tous les puits.

2. Déposer 50 µL de sérum de contrôle positif (Composant 7) dans les

puits A1 et B1.

3. Déposer 50 µL de sérum de contrôle négatif (Composant 5) dans les

puits C1 et D1.

4. Vous pouvez, éventuellement, déposer 50 µL du sérum de contrôle

servant à valider la lecture cinétique (Composant 6), dans les puits

E1 et F1.

5. Déposer 50 µL de chaque échantillon dans un seul puits (test en

simple) ou dans deux puits adjacents (test en double) de la plaque.

6. Couvrir les plaques avec le film adhésif.

7. L’agiter doucement.

8. Incuber la plaque 60±10 minutes dans une étuve à 37±1°C avec de

préférence 90% d'humidité, ou bien toute la nuit (16–18 heures) a

5±3°C.

Incubation avec le conjugue

1. Vider la plaque après l'incubation des sérums et la laver 6 fois avec

200 à 300 µL la solution de lavage. La tapoter fermement sur du papier

absorbant après le dernier cycle de lavage.

2. Distribuer 100 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits.

3. Couvrir la plaque avec un film adhésif.

4. Incuber la plaque 60±20 minutes dans une étuve à 37±1°C avec de

préférence 90% d'humidité.

Incubation avec le substrat chromogène (TMB)

1. Vider la plaque après incubation avec le conjugué et la laver 6 fois

avec 200 à 300 µL la solution de lavage diluée. La tapoter fermement

sur du papier absorbant après le dernier cycle de lavage.

2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) (Composant 8) dans

tous les puits.

3. Incuber la plaque 20 (15–30) minutes à 22±3°C.

Remarque : Il est possible, en sélectionnant cette option sur le lecteur,

de faire une lecture cinétique et de mesurer la densité optique (DO) à

650 nm à partir de 10 minutes d'incubation au minimum. Le temps

d'incubation du substrat peut être prolongé lorsque les résultats ne

correspondent pas aux critères de validation. Ne pas prolonger

l'incubation du substrat au-delà de 30 minutes.

4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 9) dans tous les puits.

5. Homogénéiser le contenu des puits.

Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 20 minutes après avoir

déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits.

Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et

le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB).

Lecture du test et calcul des résultats

1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les

15 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt.

2. Calculer la DO450 moyenne du sérum de contrôle négatif (puits C1 et

D1). Elle correspond à la DO450 max.

3. Calculer le pourcentage d'inhibition (PI) du sérum de contrôle positif,

du sérum de contrôle servant à la validation de la lecture cinétique et

des échantillons selon la formule ci-dessous.

La DO450 des échantillons est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par

rapport à la DO450 max (=DO450 du sérum de contrôle négatif).

PI = 100 − (DO450 de l'échantillon / DO450 max) × 100

Interprétation des résultats

Critères de validation basés sur la mesure de la DO à 450 nm

1. La DO450 moyenne du sérum de contrôle négatif (puits C1 et D1) doit

être >0.90.

2. Le pourcentage d'inhibition (PI) du sérum de contrôle positif doit être

>65%.

3. Le pourcentage d'inhibition (PI) du sérum de contrôle servant à la

validation de la lecture cinétique doit être >45%.

Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont

ininterprétables.

Critères de validation basés sur la mesure de la DO à 650 nm

1. La DO650 moyenne du sérum de contrôle négatif (puits C1 et D1) doit

être >0.40.

2. La DO650 moyenne du sérum de contrôle servant à la validation

cinétique (puits E1 et F1) doit être >0.15.

3. La DO650 moyenne du sérum de contrôle servant à la validation

cinétique divise par la DO650 moyenne du sérum de contrôle négatif

doit être <0.60 et >0.30.

Si ces critères ne sont pas validés, la plaque doit être remise à incuber de

manière à prolonger le développement de la coloration.

Remarque :

• Si la DO450 moyenne du sérum de contrôle négatif est inférieure à 1.000,

la solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide

au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la

solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber la plaque

plus longtemps (sans dépasser 30 minutes d'incubation).

• Si la DO450 moyenne du contrôle négatif est supérieure à 2.000, il est

conseillé de diminuer le temps d'incubation avec le substrat

chromogène (TMB).

• Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 max, le

pourcentage d'inhibition peut être considéré comme étant égal à 0%.

Interprétation du pourcentage d'inhibition

PI = ≥35% Positif

Présence d'anticorps spécifiques de la

glycoprotéine E (gE) du virus de la maladie

d'Aujeszky dans l'échantillon.

PI = <35% Négatif

Absence d'anticorps spécifiques de la

glycoprotéine E (gE) du virus de la maladie

d'Aujeszky dans l'échantillon.

Références bibliographiques

Van Oirschot J, Houwers D, Rziha H, Moonen P (1988). J Virol Methods

22 (2–3):191–206.

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion

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nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches

Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits

chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits

selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site

www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si

vous avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life

Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.

Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

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ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPONSABLES DE DOMMAGES

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Historique des révisions : Pub. N° MAN0013820 (français)

Rév.

Date

Description

A.0 30 avril 2019

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