Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV NS Ab Plate Kit Mode d'emploi

Marque
Thermo Fisher Scientific
Modèle
PrioCHECK FMDV NS Ab Plate Kit
Taper
Mode d'emploi
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit
Test ELISA pour la détection
in vitro
des anticorps spécifiques de la Fièvre aphteuse dans le sérum du bétail, des moutons,
des chèvres et des porcs
Référence Catalogue 7610440
Pub. Nº MAN0013885 Rév. B.0
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gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS.
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disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Introduction
La fièvre aphteuse constitue la menace économique la plus importante pour l'industrie animale. Cette maladie très contagieuse peut toucher une grande
partie des élevages et elle est très répandue dans le monde. Le virus de la fièvre aphteuse comporte 7 sérotypes distincts, ce qui rend assez complexe le
diagnostic avec les méthodes sérologiques classiques. Pour contrôler les épidémies qui pourraient se déclarer dans le futur, une vaccination d'urgence va
être mise en place. Le vaccin est (en partie) constitué de protéines structurales du virus de la fièvre aphteuse. Les animaux vaccinés ne produisent donc que
des anticorps dirigés contre les protéines structurales du virus. En revanche, l'infection naturelle par le virus de la fièvre aphteuse entraîne la synthèse
d'anticorps dirigés contre les protéines structurales mais aussi contre les protéines non structurales du virus. Ainsi, un ELISA détectant les anticorps dirigés
contre les protéines non structurales du virus de la fièvre aphteuse pourra dépister les animaux infectés par le virus, mais il permettra aussi de faire la
distinction entre les animaux infectés et les animaux vaccinés.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit détecte les anticorps dirigés contre la protéine non structurale 3 ABC du virus de la fièvre
aphteuse. Le test détecte les animaux infectés par le virus de la fièvre aphteuse, indépendamment du sérotype responsable de l'infection ou du statut
vaccinal de l'animal. Il peut être utilisé pour tester le bétail, les moutons, les chèvres et les porcs.
Principe du test
PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit est un ELISA de type bloquant. Les plaques sensibilisées avec un anticorps monoclonal spécifique 3ABC sont
incubées avec la protéine 3ABC. L'antigène NS du virus va alors se lier à l'anticorps monoclonal fixé sur les plaques.
Les échantillons de sérum sont ensuite distribués sur la plaque. Après incubation, la plaque est lavée et le conjugué ajouté. Les anticorps dirigés contre les
protéines non structurales (NS) du virus de la fièvre aphteuse, s'ils sont présents dans l'échantillon, vont se lier à la protéine 3ABC et bloquer la liaison de
l'anticorps monoclonal marqué à la peroxydase. La plaque est incubée et lavée, le substrat chromogène (TMB) prêt à l'emploi est ensuite distribué et la
plaque est incubée à T° ambiante (22±3°C). A la fin de la période d'incubation, le développement de la coloration est stoppé et la densité optique (DO) est
mesurée à 450 nm afin de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifiques de la fièvre aphteuse.
PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit est réalisé en effectuant une seule dilution. La dilution du sérum varie en fonction du protocole choisi.
• Protocole d’incubation du sérum de nuit: Les sérums sont dilués au 1:5 avant d'être testés.
• Protocole d’incubation du sérum sur une journée: Les sérums sont dilués au 1:2.6 avant d'être testés.
Composition du coffret
Coffret de 5 plaques pour 450 échantillons. PrioCHECK™ FMDV NS Ab
Plate Kit, s'il n'est pas utilisé immédiatement, peut être stocké à 5±3°C
jusqu'à la date de péremption. Qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée
de conservation des produits du coffret une fois dilués, ouverts ou
reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous).
Composant
Description
1 : Plaque de
microtitration
Cinq plaques de microtitration conditionnées sous
vide partiel dans des sachets contenant un
déshydratant.
2 : Conjugué (30x)
Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 2.5 mL de conjugué. Le conjugué dilué
n’est pas stable, à préparer juste avant utilisation.
3 : Tampon de dilution (2x)
Concentré 2x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 60 mL de tampon de dilution.
Conservation du tampon de dilution (1x) : 24 heures
à 5±3°C.
4 : Additif
Lyophilisé. Reconstituer avant utilisation. Cinq
flacons contenant 2.5 mL d'additif lyophilisé.
Conservation de l’additif reconstitute : jusqu’à la
date de péremption à −20°C.
5 : Eau déminéralisée
Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée.
6 : Liquide de lavage (200x)
Concentré 200x, à diluer avant utilisation. Un
flacon contient 60 mL de liquide de lavage.
Conservation de la solution (1x) : 1 semaine
à 22±3°C.
7 : Contrôle positif
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 0.6 mL de
contrôle positif.
8 : Contrôle positif faible
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 0.6 mL de
contrôle positif faible.
9 : Contrôle négatif
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 0.6 mL de
contrôle négatif.
10 : Substrat chromogène
(TMB)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
substrat chromogène (TMB).
11 : Solution d'arrêt
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de
solution d'arrêt.
Composant
Autres composants du
coffret
Equipement nécessaire mais non fourni
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur
thermofisher.com.
Use
Description
Général
Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales.
Analyse des
résultats
Lecteur de microplaques. Le lecteur doit être équipé d'un filtre
permettant de lire les plaques à 450 nm.
Optionnel
Laveur de microplaques.
Mode opératoire
Précautions
• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte.
• PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit ne doit être réalisé que dans les
laboratoires équipés pour cela.
• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement
infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être
considéré comme potentiellement contaminé.
Remarques
Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate
Kit, les précautions suivantes doivent être prises :
• Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi.
• Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C)
avant utilisation.
• L'embout des pipettes doit être changé à chaque fois qu'un nouvel
échantillon ou réactif est prélevé.
• Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif.
• Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de
péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.
• Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots
différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.
• Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau
équivalente.
2 PrioCHECK™ FMDV NS Ab Plate Kit Notice d’Utilisation
Solutions à préparer à l'avance
Tampon de dilution 1x
Diluer le tampon de dilution (Composant 3) concentré 1:2 dans de l'eau
déminéralisée. Pour une plaque : préparer 24 mL (12 mL de tampon
concentré et 12 mL d'eau déminéralisée). Peut-être conserve à 5±3°C
pendant de 24 heures.
Additif
Ramener le flacon d'additif (Composant 4) lyophilisé à T° ambiante et le
reconstituer avec de l'eau déminéralisée fournie dans le kit (volume à
ajouter : voir l'étiquette du flacon). Doit être conservé à −20°C jusqu’à la
péremption.
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
1. Ramener les flacons à 22±3°C.
2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
3. Ouvrir le flacon soigneusement.
4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée (Composant 5) spécifiée.
5. Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat se dissoudre.
6. Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.
7. Laisser le flacon reposer au moins 15 minutes à 22±3°C avant utilisation.
8. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
Tampon ELISA
Diluer l'additif reconstitué dans le tampon de dilution pour obtenir une
concentration finale de 10% (v/v). Pour une plaque : préparer 24 mL
(2.4 mL d'additif et 21.6 mL de tampon de dilution). Conserver le tampon
ELISA non utilisé à 5±3°C pendant 24 heures.
Conjugué
Préparer la dilution de travail du conjugué (Composant 2) en diluant le
conjugué dans le tampon ELISA. Pour 1 barrette : préparer 12 mL de
conjugué dilué (ajouter 400 µL de conjugué (30x) à 11.6 mL de tampon
ELISA).
Remarque : Le conjugué dilué doit être prépare juste avant utilisation.
Liquide de lavage
Diluer le liquide de lavage (concentré 200x) (Composant 6) dans l'eau
déminéralisée (voir l'étiquette du flacon). La quantité de liquide de lavage
fournie est suffisante pour préparer un volume final de 12 litres.
Stabilité du liquide de lavage dilué : 1 semaine à 22±3°C.
Remarque : Les lavages peuvent être effectués avec un laveur automatique
ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automatique, le lavage des plaques
peut être fait manuellement avec au minimum 200 µL de liquide de lavage
par puits. Puis vider la plaque et répéter le lavage autant de fois que
spécifié. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques sur du papier
absorbant entre les lavages. Tapoter fermement les plaques après le dernier
cycle de lavage.
Incubation des sérums
Réaliser l’incubation du sérum en suivant le protocole de nuit ou le
protocole sur une journée. Les volumes requis des échantillons de test et de
contrôle diffèrent en fonction du protocole choisi.
Protocole d’incubation du sérum de nuit
1. Distribuer 80 µL de tampon ELISA dans tous les puits (Composant 1).
2. Déposer 20 µL de contrôle négatif (Composant 9) dans les puits A1 et B1.
3. Déposer 20 µL de contrôle positif faible (Composant 8) dans les puits
C1 et D1.
4. Déposer 20 µL de contrôle positif (Composant 7) dans les puits E1 et F1.
5. Déposer 20 µL d'échantillon dans les autres puits.
6. Couvrir les plaques avec un film adhésif fourni dans le coffret.
7. Agiter doucement les plaques.
8. Incuber toute la nuit (16−18 heures) à 22±3°C.
Protocole d’incubation du sérum sur une journée
1. Distribuer 80 µL de tampon ELISA dans tous les puits (Composant 1).
2. Déposer 50 µL de contrôle négatif (Composant 9) dans les puits A1 et B1.
3. Déposer 50 µL de contrôle positif faible (Composant 8) dans les puits
C1 et D1.
4. Déposer 50 µL de contrôle positif (Composant 7) dans les puits E1 et F1.
5. Déposer 50 µL d'échantillon dans les autres puits.
6. Couvrir les plaques avec un film adhésif fourni dans le coffret.
7. Agiter doucement les plaques.
8. Incuber 2 heures à 22±3°C.
Incubation avec le conjugue
Remarque : cette procédure doit se faire le deuxième jour en cas
d’utilisation du protocole d’incubation du sérum de nuit.
1. Vider la plaque de test après la période d’incubation du sérum, puis
laver la plaque 6 fois avec 200 à 300 µL de solution de lavage. Les
tapoter fermement sur du papier absorbant après le dernier cycle de
lavage.
2. Distribuer 100 µL de solution de travail du conjugué dans tous les puits.
3. Couvrir les plaques à l'aide des films adhésifs fournis dans le coffret.
4. Incuber 60±5 minutes à 22±3°C.
Incubation avec le substrat chromogène
1. Vider les plaques après incubation et laver 6 fois avec 200 à 300 µL le
liquide de lavage. Les tapoter fermement sur du papier absorbant après
le dernier cycle de lavage.
2. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) dans tous les puits.
3. Incuber 20 minutes à 22±3°C.
4. Distribuer 100 µL de solution d'arrêt (Composant 11) dans tous les puits.
5. Homogénéiser le contenu des plaques avant de mesurer la densité
optique (DO).
Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 20 minutes après avoir
déposé la solution de substrat chromogène (TMB) dans le premier puits.
Distribuer la solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même ordre et
le même rythme que pour distribuer le substrat chromogène (TMB).
Lecture du test et calcul des résultats
1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes
suivant l'addition de la solution d'arrêt.
2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 and B1 (contrôle négatif
= DO450 max).
3. Le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de contrôle et des
échantillons est calculé selon la formule ci-dessous.
La DO450 des échantillons est exprimée en pourcentage d'inhibition (PI) par
rapport à la DO450 max.
PI = 100 − (DO450 de l’échantillon / DO450 max) × 100
Interprétation des résultats
Validation des critères
1. La DO450 max (DO450 moyenne du contrôle négatif) doit être >1.000.
2. Le pourcentage d'inhibition du contrôle positif faible doit être >50%.
3. Le pourcentage d'inhibition du contrôle positif doit être >70%.
Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la série de tests sont
ininterprétables.
Remarque : Si la DO450 d'un échantillon est supérieure à la DO450 max, le
pourcentage d'inhibition peut être considéré comme étant égal à 0%. Si la
DO450 moyenne du contrôle négatif (DO450 max) est inférieure à 1.000, la
solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide au
moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de
substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber les plaques plus longtemps
(sans dépasser 30 minutes d'incubation).
Interprétation du pourcentage d'inhibition
PI <50% Négatif
Absence d'anticorps spécifiques de la protéine NS
du virus de la fièvre aphteuse dans le prélèvement.
PI ≥50% Positif
Présence d'anticorps spécifiques de la protéine NS
du virus de la fièvre aphteuse dans le prélèvement.
Références bibliographiques
Sørensen KJ, Madsen KG, Madsen ES, Salt JS, Nqindi J, Mackay DKJ (1998)
Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by
the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and
3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus. Arch Virol
143:1461–1476.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
20 June 2022
Service clientèle et assistance technique
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• Certificats d’analyse
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Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits
chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits
selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous
avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
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DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0013885 (français)
Rév.
Date
Description
B.0
20 June 2022
Suppression de la recommandation d’une période d’incubation plus
courte avec le substrat chromogène (TMB) si la
DO450 moyenne du
contrôle négatif est supérieure à 2,000.
A.0 22 octobre 2019
• Conversion effectuée du document existant (PrioCHECK FMDV-NS 5
solid 7610440_v1.0_f.doc) sur le modèle du document en cours,
avec mises à jour associées aux informations de licence limitée, à la
garantie, aux marques et aux logos.
• Ajout du protocole d’incubation du sérum sur une journée.
• Changement du nom du kit de PrioCHECK® FMDV NS en
PrioCHECK
™
FMDV NS Ab Plate Kit.
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licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions générales de toutes
les licences à usage limité.
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