Thermo Fisher Scientific VetMAX Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit

PCR temps réel TaqMan™ pour la détection de

Chlamydophila

spp.

Référence Catalogue CHLPEXO50

Partie Nº 100020358 Pub. Nº MAN0008735 Rév. C.0

Technique

Espèce(s)

Acides nucléiques isolés à partir des matrices

Test

PCR temps réel (ADN)

– Duplex

– IPC exogène

Toutes espèces

Placenta

Tissu ou liquide fœtal

Lait

Mucus vaginal

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la

détection par PCR temps réel de Chlamydophila spp.

Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ADN bactérien de Chlamydophila spp. et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC

traduit à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ADNs bactériens extraits à partir de placenta, de tissu ou liquide fœtal, de lait et de mucus vaginal.

Les protocoles complets d’extractions des ADN bactériens à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support

Technique.

Réactifs du kit et conservation

VetMAX™ Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la

détection en duplex de Chlamydophila spp. et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre

−30°C et −10°C. Après première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :

Article Description Volume

(50 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

1 - Sequences Chlam Exo

(Tube vert)

Pool de séquences (primers et sondes). Il contient :

• Le système de détection pour la cible

Chlamydophila spp., comprenant une sonde TaqMan™

marquée FAM™ - TAMRA™.

• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une

sonde TaqMan

™

marquée VIC

™

- TAMRA

™

100 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

2 - Master Mix Chlam Exo

(Tube blanc)

Mix pour PCR temps réel TaqMan™. Il contient le tampon

et l’enzyme de PCR temps réel.

625 µL −30°C à −10°C 2°C à 8°C

4a - EPC Chlam Exo

(Tube marron)

External Positive Control :

Contrôle positif en Chlamydophila spp. Il s'agit d'acides

nucléiques déjà extraits à amplifier lors de la PCR

temps réel.

90 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

5 - IPC Chlam Exo

(Tube jaune)

Internal Positive Control :

Contrôle interne exogène, à ajouter dans chaque

échantillon lors de l’étape d’extraction.

250 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

NOTE : Pour de petites séries d’extraction, il est conseillé d’aliquoter l’IPC Chlam Exo à la première utilisation, afin d’éviter plus de 3

cycles de congélation-décongélation (Sous un volume minimum de 50 µL).

Témoins d’extraction et d’amplification

VetMAX™ Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit contient 2 témoins permettant la validation de l’extraction et de l’amplification des

ADN bactériens :

VetMAX

™

Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit Notice d’Utilisation

4a - EPC Chlam Exo : contrôle positif en Chlamydophila spp.

Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la PCR temps réel.

Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible Chlamydophila spp. par PCR

temps réel.

5 - IPC Chlam Exo : contrôle interne d’extraction

Contrôle positif à ajouter dans chaque échantillon lors de l’étape d’extraction des acides nucléiques.

Un résultat IPC positif avec une valeur comprise dans l’intervalle accepté de Ct dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet

échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques (avec ajout d’IPC) puis PCR temps réel.

Un résultat négatif en Chlamydophila spp. permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la PCR temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Un résultat négatif pour Chlamydophila spp. et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des

réactions pour la PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),

microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :

• Mix Chlam Exo : 20 µL par analyse. A reconstituer extemporanément avant la PCR temps réel.

• ADN extrait : 5 µL par analyse.

Extraction des ADN bactériens

Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.

Ajouter 5 µL de 5 - IPC Chlam Exo par échantillon et au NCS lors de l’étape d’extraction des acides nucléiques.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit,

merci de contacter le Support Technique.

Reconstitution du mix réactionnel

Reconstituer le Mix Chlam Exo juste avant emploi, dans une pièce dédiée à la préparation des mix :

1. A la première utilisation, décongeler le tube de 2 - Master Mix Chlam Exo entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

Le conserver et maintenir entre 2°C et 8°C à chaque utilisation suivante.

2. Décongeler le tube de 1 - Sequences Chlam Exo à température ambiante entre 17°C et 25°C. Le replacer entre −30°C et −10°C après

utilisation.

3. Reconstituer entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant, le mix réactionnel Mix Chlam Exo selon les tables de calcul

suivantes :

Composant

Pour 1 réaction

Pour N réactions

(1)

1 - Sequences Chlam Exo

2 µL

N × 2 µL

2 - Master Mix Chlam Exo

12.5 µL

N × 12.5 µL

Eau RNase/DNase-free

5.5 µL

N × 5.5 µL

Volume total

20 µL

N × 20 µL

(1) Il est recommandé de prévoir une réaction supplémentaire par rapport au total de réactions qui seront réalisées lors des analyses (échantillons +

contrôles). Ne jamais mélanger les réactifs issus de lots de kits différents (se référer au Certificat d’Analyse).

4. Après reconstitution, procéder immédiatement à la PCR temps réel. Maintenir le tube de Mix Chlam Exo entre 2°C et 8°C, sur glace

ou sur un portoir réfrigérant jusqu’à utilisation.

VetMAX

™

Chlamydophila spp. Exogenous IPC Kit Notice d’Utilisation

Préparation de la PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres

échantillons.

2. Homogénéiser le tube Mix Chlam Exo par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

3. Distribuer 20 µL de Mix Chlam Exo par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

4. Ajouter les ADN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant

Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ADN extraits de l’échantillon

5 µL

Contrôle positif d’amplification

4a - EPC Chlam Exo

5 µL

Contrôle négatif d'extraction (NCS)

NCS extrait

5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free

5 µL

5. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

Amplification par PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter

Quencher

CHLP

FAM™

TAMRA™(1)

IPC CHLP

VIC™

TAMRA™(1)

Référence passive : ROX™(1)

(1) Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.

Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur CHLP et le détecteur IPC CHLP dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape

Température

Durée

Etape 1 ×1 50°C 2 minutes

Etape 2 ×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×45 95°C 15 secondes

60°C(1) 1 minute

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les

recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur CHLP

Détecteur IPC CHLP

Validation

EPC Chlam

Ct = Ct QC CHLP de 4a- EPC Chlam Exo ± 3Ct

(1)

Ct < 45 ou Ct > 45

(2)

PCR validée

NCS

> 45

= C

t QC

IPC de 5 - IPC Chlam Exo ± 3C

t(3)

Extraction validée

> 45

Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

(3) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.2 « IPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur CHLP

Détecteur IPC CHLP

Interprétation

Ct < 45

Ct < 45 ou Ct > 45

Chlamydophila spp. détecté

Ct > 45

Ct ≤ Ct IPC du NCS ± 3Ct

(1)

Chlamydophila spp. non détecté

Ct > 45

Ct > Ct IPC du NCS ± 3Ct

(1)

Non validé

(2)

(1) Se référer à la valeur de Ct IPC obtenue pour le NCS réalisé lors d’une même série d’extraction que les échantillons à analyser. La valeur du Ct IPC obtenue

pour ce NCS doit préalablement être validée comme décrit précédemment.

(2) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

1 novembre 2022

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ADN dilué est positif en Chlamydophila spp. ou négatif en Chlamydophila spp. avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu

est alors validé.

4. Si l’ADN dilué est négatif en Chlamydophila spp. avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans

ce cas, renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique,

notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles

sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact

avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

SABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.

Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008735 (français)

Révision

Date

Description

C.0 1 novembre 2022

Le NFQ (Non-Fluorescent Quencher) a été remplacé par TAMRA™ dans les sections « Conditions de conservation et

composants du kit » et « Amplification par PCR en temps réel ».

B.0

5 mai 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

25 novembre 2013

Base de référence pour l’historique de révision

Informations de licence importantes : Ces produits peuvent ou non être soumis à une ou plusieurs Licences à usage limité. En utilisant ces produits, l’acquéreur accepte les

conditions générales de toutes les Licences à usage limité.