Thermo Fisher Scientific VetMAX L. intracellularis Kit Mode d'emploi

Marque
Thermo Fisher Scientific
Modèle
VetMAX L. intracellularis Kit
Taper
Mode d'emploi
Pour usage en laboratoire.
GUIDE COMPLEMENTAIRE
VetMAX™ L. intracellularis Kit
Protocoles de purification d'acides nucléiques
En association avec la Référence Catalogue LAWP50
Partie Nº 100021165 Pub. Nº MAN0008794 Rév. B.0
Espèce(s)
Isolation des acides nucléiques à partir des matrices
Test
Porcins
Fèces
Individuel
Sommaire
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2
Contenu de ce manuel ......................................................................................................................................................................... 2
Choix des échantillons ......................................................................................................................................................................... 2
Conservation des échantillons ............................................................................................................................................................. 2
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ........................................................................................................ 3
Protocoles d’extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................... 3
Extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................... 4
Préparation des échantillons avant extraction ..................................................................................................................................... 4
Extraction avec le MagVet™ Universal Isolation Kit............................................................................................................................... 5
Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit............................................................................................................................................. 6
Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue ............................................................................................................................................ 7
Documentation et support ............................................................................................................................................... 8
Service clientèle et assistance technique ............................................................................................................................................ 8
Garantie produit limitée ....................................................................................................................................................................... 8
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
2 VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire
Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques
Contenu de ce manuel
Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ADNs bactériens du Lawsonia intracellularis compatibles avec
Applied Biosystems™ VetMAX™ L. intracellularis Kit.
Choix des échantillons
Matrice Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement
Fèces Individuelle 1 g de fèces dans un pot à fèces
Conservation des échantillons
Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique.
Fèces
Suite au prélèvement, maintenir entre +2°C et +8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 8 jours après prélèvement. Après
utilisation ou passé le délai de 8 jours, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une
conservation au-delà de 1 an.
VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire 3
Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse
• Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II
• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre
• Un vortex ou équivalent
• Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL
• Balance de précision
• Billes de verre de 5 mm
• Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL
• Tampon PBS 1X
• Eau DNase/RNase-free
Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ADN des échantillons
Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape.
S’assurer en plus de disposer des éléments suivants :
• Ethanol 96–100% ou éthanol 80% selon l’extraction réalisée
• Extraction automatisée en billes magnétiques :
– MagVet™ Universal Isolation Kit (Réf. MV384)
– Automate d’extraction : renseignements disponibles sur demande au Support Technique.
• Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel :
– QIAamp™ DNA Mini Kit (QIAGEN™) ou NucleoSpin™ Tissue (MACHEREY-NAGEL)
– Une centrifugeuse pour microtubes
Protocoles d’extraction de l’ADN
Kits d’extraction recommandés
Fèces
MagVet™ Universal Isolation Kit
QIAamp™ DNA Mini Kit
NucleoSpin™ Tissue
4 VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire
Extraction de l’ADN
Préparation des échantillons avant extraction
Fèces
1. Dans un tube de 10 mL, peser 1 g de fèces, ajouter 10 mL d’eau distillée stérile et 3 billes de 5 mm.
2. Vortexer les tubes pendant 1 minute pour bien homogénéiser les fèces.
3. Transférer 1 mL de surnageant dans un tube de 2 mL.
4. Centrifuger le tube 2 minutes à 1000 × g – Conserver le surnageant pour l’extraction de l’ADN.
Optionnel : A la place du point 5, il est possible de filtrer le surnageant de fèces :
1. Transférer 1 mL d’échantillon dans une QIAshredder Spin Column (en deux fois).
2. Centrifuger le tube 2 minutes à 15 000 × g – Conserver l’éluât (tube collecteur) pour l’extraction de l’ADN.
VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire 5
Extraction avec le MagVet™ Universal Isolation Kit
Remarques
Le protocole d’extraction sur billes magnétiques présenté est utilisable indifféremment avec les automates KingFisher™ mL et
KingFisher™ 96/Flex. En effet, seul le nombre d’échantillons traités diffère.
Ce protocole requiert l’utilisation de réactifs externes au MagVet™ Universal Isolation Kit :
• La protéinase K : 20 µL de protéinase K de QIAGEN™ ou 25 µL de protéinase K de MACHEREY-NAGEL (reconstitué) par échantillon
Avant de commencer
• Reconstitution de la solution NM1 : Transvaser la totalité de la solution N1 (100 mL) dans la bouteille contenant la solution M1 (25 mL),
bien vortexer. Le tampon de lyse NM1 (125 mL) ainsi obtenu est stable 1 an à température ambiante.
• Reconstitution de la solution NM2+Billes : Chaque réaction requiert 20 µL de NM_LSI_Beads et 600 µL de tampon de binding NM2.
Il est conseillé de reconstituer cette solution juste avant utilisation et de ne pas la conserver ensuite. Bien homogénéiser la solution
contenant les billes en la vortexant juste avant utilisation.
• Reconstitution de la protéinase K : reconstituer selon les recommandations du fournisseur de la protéinase K utilisée.
• Préparer et identifier le nombre de microtubes, de barrettes d’extraction et de plaques d’extraction correspondant au nombre
d’échantillons à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs).
Protocole
1. Réaliser la lyse des échantillons dans des microtubes 1.5 mL ou 2 mL, comme décrit ci-dessous :
Echantillon pour analyse NCS
Solution de lyse
180 µL de NM1
+ 20 µL de protéinase K QIAGEN™ ou
25 µL de protéinase K MACHEREY-NAGEL
180 µL de NM1
+ 20 µL de protéinase K QIAGEN™ ou
25 µL de protéinase K MACHEREY-NAGEL
Prise d’essai
200 µL d’échantillon
200 µL de PBS 1X
IPC
5 µL de 5 - IPC Lawsonia
5 µL de 5 - IPC Lawsonia
2. Incuber 30 minutes à +70°C.
3. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
4. Préparer les consommables pour la série d’extraction :
• Pour l’automate KingFisher™ mL : sortir le plateau coulissant de l’automate et positionner les barrettes d’extraction dessus,
pour distribution des tampons sur paillasse.
• Pour l’automate KingFisher™ 96/Flex : les tampons seront distribués dans les plaques sur paillasse.
5. Préparer l’extraction en automate comme décrit ci-dessous :
• Dans le cas d’une extraction avec l’automate KingFisher™ mL, transférer la totalité des lysats dans les puits A des barrettes
d’extraction.
• Dans le cas d’une extraction avec l’automate KingFisher™ 96/Flex, transférer la totalité des lysats dans une plaque Deep Well
qui sera directement utilisée comme plaque 1.
Position de la
barrette ou plaque Réactifs Échantillon pour analyse NCS
A / 1
B / 2
C / 3
D / 4
E / 5
6. Après distribution de ces tampons, ajouter 620 µL de solution NM2+Billes (ou 600 µL de NM2 et 20 µL de billes) pour chaque
échantillon dans le puits en position A de la barrette ou la plaque 1 (selon l’automate utilisé).
7. Positionner les peignes protecteurs des barreaux aimantés.
8. Placer les barrettes ou plaques dans l’automate.
9. Lancer le run d’extraction :
• Script NM_LSI_15prep pour l’automate KingFisher™ mL
• Script NM_LSI_RRC96 pour l’automate KingFisher™ 96/Flex
10. A la fin du run d’extraction :
a. Sur l’automate KingFisher™ mL : transférer les éluâts contenus en position E de la barrette d’extraction dans des microtubes
préalablement identifiés.
b. Sur l’automate KingFisher™ 96/Flex : recouvrir la plaque d’élution (plaque 5) avec un film adapté.
c. Jeter les autres consommables plastiques utilisés pour l’extraction (plaques, barrettes, peignes).
Maintenir les éluâts obtenus (plaque fermée ou microtube) entre +2°C et +8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en
dessous de −16°C.
6 VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire
Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit
Avant de commencer
• Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la
première utilisation.
• Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs).
Protocole
1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Echantillon pour analyse NCS
Solution de lyse 200 µL de Buffer AL + 20 µL de protéinase K 200 µL de Buffer AL + 20 µL de protéinase K
Prise d’essai 200 µL d’échantillon 200 µL de PBS 1X
IPC 5 µL de 5 - IPC Lawsonia 5 µL de 5 - IPC Lawsonia
2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3. Incuber 30 minutes à +70°C.
4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
5. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement
le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
6. Prendre une mini-colonne du QIAamp™ DNA Mini Kit - Identifier la colonne.
7. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15 000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
8. Distribuer 500 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15 000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
9. Distribuer 500 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15 000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 15 000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 100 µL de buffer AE - Boucher.
12. Incuber 1 minute à température ambiante.
13. Centrifuger 1 minute à 15 000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre +2°C et +8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
VetMAX™ L. intracellularis Kit Guide Complémentaire 7
Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue
Avant de commencer
• Reconstitution Buffer B5 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
• Reconstitution de la protéinase K : ajouter la quantité requise de buffer PB selon les recommandations du fournisseur avant la première
utilisation.
• Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins
négatifs).
Protocole
1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :
Echantillon pour analyse NCS
Solution de lyse 200 µL de Buffer B3 + 25 µL de protéinase K 200 µL de Buffer B3 + 25 µL de protéinase K
Prise d’essai 200 µL d’échantillon 200 µL de PBS 1X
IPC 5 µL de 5 - IPC Lawsonia 5 µL de 5 - IPC Lawsonia
2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.
3. Incuber 30 minutes à +70°C.
4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.
5. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement
le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.
6. Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ Tissue - Identifier la colonne.
7. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11 000 × g - Jeter le tube collecteur
- Conserver la colonne.
8. Distribuer 500 µL de buffer BW dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11 000 × g - Jeter le tube collecteur -
Conserver la colonne.
9. Distribuer 600 µL de buffer B5 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11 000 × g - Jeter le tube
collecteur - Conserver la colonne.
10. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 11 000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le
tube collecteur - Conserver la colonne.
11. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 100 µL de buffer BE - Boucher.
12. Incuber 1 minute à température ambiante.
13. Centrifuger 1 minute à 11 000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.
Maintenir les éluâts obtenus entre +2°C et +8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
12 février 2019
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
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notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))
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Garantie produit limitée
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sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact
avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
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Historique des révisions : Pub. N° MAN0008794 (français)
Révision
Date
Description
B.0
12 février 2019
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
A.0
1 novembre 2013
Base de référence pour l’historique de révision
Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288
©2019 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
NucleoSpin est une marque de MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH.
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