Thermo Fisher Scientific PrioCHECK PRV gB serum pig 7589100 Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: PrioCHECK PRV gB serum pig 7589100

Taper: Mode d'emploi

PrioCHECK

PRV gB

Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques de la glycoprotéine B (gB)

du virus de la maladie d'Aujeszky dans le sérum de porcs

Coffret de 5 plaques pour 450 échantillons

Prionics AG

Version 1.0_f

Pour diagnostic in vitro uniquement

Usage strictement vétérinaire

Conserver à 5±3°C

Produit No.: 7589100

Introduction

Le virus de la maladie d'Aujeszky (MA) ou pseudo-

rage, est un herpèsvirus responsable d'une infection

virale largement répandue dans le monde, qui touche

principalement le porc, entraînant des pertes écono-

miques importantes au niveau de l'industrie porcine.

Les manifestations cliniques sont variées: atteintes du

système nerveux, du système respiratoire, troubles de

la reproduction, mort de l'animal. Le test PrioCHECK

PRV gB détecte dans le sérum des porcs infectés, les

anticorps dirigés contre la glycoprotéine B (gB) du

virus de la MA. La glycoprotéine B (dont l'ancienne

nomenclature est gII) est l'un des composants majeurs

de l'enveloppe virale qui est indispensable au proces-

sus d'infection et à l'induction de la synthèse d'anti-

corps neutralisants. Le test est d'une très grande utilité

pour détecter les porcs infectés naturellement par

différentes souches virales ainsi que les porcs (illéga-

lement) vaccinés avec des vaccins conventionnels ou

avec des vaccins marqueurs.

Le test PrioCHECK

PRV gB qui détecte les anticorps

spécifiques du virus de la maladie d'Aujeszky (MA)

dans le sérum des porcs peut être utilisé pour:

- surveiller le statut d'indemne de MA des troupeaux

de porcs.

- détecter les anticorps anti-MA après vaccination

(illégale) avec un vaccin conventionnel ou un vac-

cin marqueur.

- surveiller le taux d'anticorps anti-MA chez les porcs

après vaccination.

- diagnostiquer l'infection à l'échelle individuelle ou à

l'échelle du troupeau.

Principe du test

Le test PrioCHECK

PRV gB est un ELISA bloquant

qui détecte les anticorps dirigés contre le virus de la

maladie d'Aujeszky (MA). La liaison entre un épitope

situé sur la glycoprotéine B (gB) du virus de la MA et

un anticorps monoclonal spécifique est bloquée par

les anticorps spécifiques présents dans l'échantillon.

Un antigène non infectieux du virus de la MA est coaté

dans une microplaque. Le sérum de porc non dilué est

ajouté dans les puits. La plaque est incubée 1 heure à

37±1°C ou à T° ambiante (22±3°C). Le conjugué, qui

est un anticorps monoclonal marqué à la peroxydase,

est ensuite distribué dans tous les puits et la plaque

est incubée à nouveau 1 heure à 37±1°C ou à

22±3°C. Après lavage des puits, le substrat chromo-

gène (TMB) est ajouté et incubé 20 minutes. Le

développement de la coloration est stoppé et la densi-

té optique (DO) est mesurée à 450 nm.

Composition du coffret

Le coffret PrioCHECK

PRV gB, s’il peut être stocké à

5±3°C jusqu’à la date de péremption qui figure sur

l'étiquette du coffret. La durée de conservation des

produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou reconsti-

tués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-

dessous). Les informations sur les risques chimiques

sont données dans le paragraphe « Normes de Sécu-

rité - Risque et Sécurité » (Annexe II).

Composant 1

Microplaque

Cinq microplaques conditionnées sous vide partiel

dans des sachets contenant un déshydratant.

Composant 2

Conjugué (30x)

(concentré 30x, à diluer avant utilisation). Un flacon

contenant 2,5 ml de conjugué.

Le conjugué dilué n’est pas stable, à preparer juste

avant utilisation.

Composant 3

Tampon de dilution (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution.

Composant 4

Liquide de lavage (200x)

(concentrée 200x, à diluer avant utilisation). Un flacon

contenant 60 ml de solution de lavage.

Conservation de la solution: 1 semaine à 22±3°C.

Composant 5

Eau déminéralisée

Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée.

Composant 6

Sérum de cheval (lyophilisé)

Un flacon contenant 6,0 ml de sérum de cheval lyophi-

lisé.

Le serum de cheval reconstitute peut être conserve à

-20°C jusqu’à la date de péremption.

Composant 7

Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 2,5 ml de sérum de contrôle 1.

Composant 8

Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 2,5 ml de sérum de contrôle 2.

Composant 9

Sérum de contrôle 3 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 2,5 ml de sérum de contrôle 3.

Composant 10

Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène

(TMB).

Composant 11

Solution d'arrêt (prête à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt.

Autres composants du coffret:

- Notice d'utilisation

- 10 films adhésifs pour couvrir les plaques

- Certificat d'analyse

Equipement nécessaire mais non

fourni

Equipement général:

Equipement de laboratoire aux normes de sécurité

nationales.

Incubation:

Incubateur de microplaque (chauffant au moins à

50°C).

Analyse des résultats:

Lecteur de microplaques: Multiscan EX ou équivalent.

Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire

les plaques à 450 nm.

Equipement optionnel:

Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray

Washer ou équivalent.

Mode opératoire

Précautions

Les recommandations nationales pour la manipulation

d'échantillons animaux doivent être suivies de façon

stricte. Le test PrioCHECK

PRV gB ne doit être

réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela.

Les échantillons doivent être considérés comme

potentiellement infectieux. Tout matériel en contact

avec ces échantillons doit être considéré comme

potentiellement contaminé.

Les informations sur les risques chimiques sont

données dans le paragraphe « Normes de Sécurité -

Risque et Sécurité » (Annexe II).

Remarques

Pour obtenir des résultats optimums avec Prio-

CHECK

PRV gB, les précautions suivantes doivent

être prises:

 Le mode opératoire doit être rigoureusement

suivi.

 Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à

T° ambiante (22±3°C) avant utilisation.

 L'embout des pipettes doit être changé chaque fois

qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé.

 Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour

chaque réactif.

 Les composants du coffret ne doivent pas être

utilisés après la date de péremption ou si un chan-

gement dans leur aspect est observé.

 Les réactifs provenant de coffrets portant des

numéros de lots différents, ne doivent pas être as-

sociés dans une même série de tests.

 Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée

ou une eau équivalente.

SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE

Sérum de cheval

Reconstituer

le sérum de cheval (Composant 6)

lyophilisé avec 6 ml de l'eau déminéralisée (Compo-

sant 5). Le sérum de cheval reconstitué peut être

conservé à -20°C jusqu’à la date de péremption.

Tampon ELISA

Mélanger 1 volume de sérum de cheval reconstitué

avec 9 volumes de tampon de dilution (Composant 3)

(concentration finale de sérum de cheval dans le

tampon: 10%).

Pour chaque série de tests, utiliser du tampon ELISA

fraîchement préparé. Il faudra donc veiller à préparer

uniquement la quantité de tampon ELISA nécessaire à

chaque série de tests (préparer 11 ml par plaque).

Dilution du Conjugué

Préparer la dilution de travail du conjugué (30x)

(Composant 2) en diluant le conjugué dans 1/30 le

tampon ELISA. Pour une plaque: préparer un volume

de 11 ml.

Remarque: La dilution de travail du conjugué doit

être préparée juste avant utilisation.

Solution de lavage

La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être

diluée dans 1/200 de l'eau déminéralisée. La quantité

fournie permet de préparer un volume final de 12

litres.

Stabilité de la solution de lavage diluée: 1 semaine à

22±3°C.

Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :

- Ramener le flacon à 22±3°C.

- Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour

s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.

- Ouvrir le flacon.

- Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée .

- Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le

lyophilisat soit entièrement dissout.

- Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.

- Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la

formation de mousse).

Notice d'utilisation

PrioCHECK

PRV gB

Remarque: Les lavages peuvent être effectués avec un laveur

automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur automati-

que, le lavage des plaques peut être fait manuellement avec

200 à 300 µl de solution de lavage par puits. Vider ensuite les

plaques et répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est

pas nécessaire d'égoutter les plaques sur du papier absorbant

entre les lavages. Les tapoter fermement sur du papier absor-

bant après le dernier cycle de lavage.

INCUBATION DES SERUMS

1.1 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 1 (Compo-

sant 7) dans les puits A1 et B1 de la plaque test

(Composant 1).

1.2 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 2 (Compo-

sant 8) dans les puits C1 et D1.

1.3 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 3 (Compo-

sant 9) dans les puits E1 et F1.

1.4 Déposer 100 µl de chaque échantillon dans les

autres puits.

1.5 Couvrir la plaque avec un film adhésif et l'agiter

doucement.

1.6 Incuber 60±5 minutes à 37±1°C (ou à 22±3°C).

INCUBATION AVEC LE CONJUGUE

2.1 Vider la plaque après la période d'incubation et

la laver 6 fois avec 200 à 300 µl la solution de

lavage. La tapoter fermement sur du papier ab-

sorbant après le dernier cycle de lavage.

2.2 Distribuer 100 µl de solution de travail du conju-

gué dans tous les puits.

3.2 Couvrir la plaque avec un film adhésif et l'agiter

doucement.

2.4 Incuber 60±5 minutes à 37±1°C (ou à 22±3°C).

INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE

(TMB)

3.1 Vider la plaque après la période d'incubation et

la laver 6 fois avec 200 à 300 µl la solution de

lavage. La tapoter fermement sur du papier ab-

sorbant après le dernier cycle de lavage.

3.2 Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB)

(Composant 10) dans tous les puits.

3.3 Incuber 20 minutes à 22±3°C.

3.4 Ajouter 100 µl de solution d'arrêt (Composant

11).

3.5 Homogénéiser le contenu des puits.

Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt

20 minutes après avoir déposé la solution de substrat

chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la

solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même

ordre et le même rythme que pour distribuer le subs-

trat chromogène (TMB).

LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS

4.1 Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450

nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la

solution d'arrêt.

4.2 Calculer la DO

450

moyenne des puits E1 et F1 (=

450

max).

4.3 Le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums de

contrôle et des échantillons est calculé selon la

formule ci-dessous.

Remarque: La DO

450

des échantillons est exprimée en

pourcentage d'inhibition (PI) par rapport à la

450

max [= DO

450

moyenne des puits E1 et F1]

450

de l'échantillon

PI = 100 - -------------------------------------------- x 100

450

max

INTERPRETATION DES RESULTATS

Validation des critères

5.1 La DO

450

max doit être au moins égale à 1,000.

5.2 Le pourcentage d'inhibition du sérum de

contrôle 1 doit être > 50%.

5.3 Le pourcentage d'inhibition du sérum de

contrôle 2 doit être < 50%.

5.4 Si ces critères ne sont pas validés, les résultats

de la série de tests sont ininterprétables.

Remarque: Si la DO

450

max moyenne est inférieure à

1,000, la solution de substrat chromogène (TMB) était

peut-être trop froide au moment de son utilisation.

Dans ce cas, penser à ramener la solution de substrat

à 22±3°C avant utilisation ou incuber plus longtemps

la plaque (sans dépasser 30 minutes d'incubation).

Interprétation du pourcentage d'inhibition

PI ≥ 50% Positif

Présence d'anticorps spécifiques de la glycoprotéine B

(gB) du virus de la maladie d'Aujeszky dans l'échantil-

lon.

PI < 50% Négatif

Absence d'anticorps spécifiques de la glycoprotéine B

(gB) du virus de la maladie d'Aujeszky dans l'échantil-

lon.

Annexe I

Avertissement

Les informations contenues dans cette notice sont

considérées comme étant complètes et exactes au

moment de leur publication. Prionics AG ne peut en

aucun cas être tenu pour responsable des dommages

fortuits ou indirects liés à l'utilisation de ce document

ou en résultant.

Responsabilité

Prionics AG garantit que ses produits sont conformes

aux caractéristiques décrites sous réserve qu'ils soient

utilisés selon les instructions fournies et dans les

délais de conservation indiqués. Prionics AG exclut

toute autre garantie, explicite ou implicite, y compris la

garantie d'aptitude à la vente ou de conformité pour

une utilisation particulière. La garantie mentionnée ici,

ainsi que les informations, spécifications et descrip-

tions des produits commercialisés par Prionics AG

figurant dans les catalogues Prionics AG ou dans tout

autre document, ne peuvent pas être modifiées, sauf

consentement écrit express de Prionics AG. Les

présentations orales ou écrites, ou les publications

non conformes à cette garantie ne sont pas autorisées

et sont sujettes à caution.

En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prio-

nics AG se limite à la réparation ou à l'échange, à sa

discrétion, du produit ou d'une partie du produit, sous

réserve que le client informe rapidement Prionics AG

de cette rupture de garantie. Au cas où la société

Prionics AG ne pourrait pas réparer ou remplacer le

produit ou une partie du produit, elle devra rembourser

au client l'intégralité des sommes perçues pour ce

produit ou pour partie de ce produit.

Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des

dommages fortuits, particuliers ou indirects y compris

ceux résultant d'une perte économique ou d'un dom-

mage matériel subis par un client suite à l'utilisation de

ses produits.

Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entrepri-

ses certifiées ISO 9001:2000.

Annexe II

Normes de Sécurité - Risque et Sécurité

1. Les Normes de Sécurité Nationales doivent être

appliquées de façon stricte.

2. Risque et Sécurité

Composant 1

Microplaque