6 VetMAX™ European BTV Typing Kit Guide Complémentaire
Extraction avec le MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit
Remarques
Le protocole d’extraction sur billes magnétiques présenté ici s’utilise avec l’automate MagMAX™ Express.
Ce protocole n’est utilisable que pour l’extraction à partir de sangs totaux prélevés en tubes EDTA.
Avant de commencer
• Préparation du tampon de lyse TL : Reconstituer le tampon de lyse come décrit ci-après :
Pour 1 échantillon Pour N échantillons(1)
Lysis/Binding Solution Concentrate 70 µL N × 70 µL
Carrier RNA(2) 1 µL N × 1 µL
Vortexer brièvement
Ajouter l’isopropanol 100% 70 µL N × 70 µL
Vortexer
(1) Il est recommandé de prévoir une réaction supplémentaire par rapport au total d’extractions à réaliser (échantillons + contrôles).
(2) Le carrier RNA peut prendre un aspect visqueux une fois décongelé, ce qui rend le pipetage plus difficile. Dans ce cas, placer le tube à 37°C pendant
10 à 15 minutes, vortexer vigoureusement et centrifuger.
Une fois reconstitué, le tampon de lyse TL est stable 1 mois à température ambiante, il ne faut pas le conserver entre 2°C et 8°C
car le RNA carrier risque de précipiter. Si par erreur le TL est placé entre 2°C et 8°C, il est conseillé de l'incuber avant utilisation
10 à 15 minutes à 37°C puis de bien l'homogénéiser.
• Reconstitution du tampon lavage 1 : ajouter la quantité requise d’isopropanol 100% au flacon Wash Solution 1 Concentrate selon les
recommandations du fournisseur avant la première utilisation.
• Reconstitution du tampon lavage 2 : ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% au flacon Wash Solution 2 Concentrate selon les
recommandations du fournisseur avant la première utilisation.
• Reconstitution de la solution Mix Beads : Chaque réaction requiert 10 µL de RNA Binding Beads et 10 µL de Lysis/Binding Enhancer.
Il est conseillé de reconstituer cette solution juste avant utilisation et de ne pas la conserver ensuite. Bien homogénéiser par agitation
douce et placer entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation.
• Préparer et identifier le nombre de microtubes, de barrettes d’extraction et de plaques d’extraction correspondant au nombre
d’échantillons à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs).
Protocole
1. Préparer les consommables pour la série d’extraction : les tampons seront distribués dans les plaques sur paillasse.
2. Réaliser la lyse et la purification des échantillons comme décrit ci-dessous (Ajouter les composants en ligne A dans l’ordre
indiqué) :
Ligne de la
plaque Réactifs Échantillon pour analyse NCS
A Billes magnétiques 20 µL de Mix Beads 20 µL de Mix Beads
Prise d’essai 50 µL d’échantillon —
B Solution lavage 1 170 µL Tampon lavage 1 170 µL Tampon lavage 1
C Solution lavage 1 170 µL Tampon lavage 1 170 µL Tampon lavage 1
D Solution lavage 2 170 µL Tampon lavage 2 170 µL Tampon lavage 2
E Solution lavage 2 170 µL Tampon lavage 2 170 µL Tampon lavage 2
F Tampon d’élution 50 µL Tampon d’élution 50 µL Tampon d’élution
3. Après distribution de ces tampons, ajouter 140 µL de tampon de lyse TL pour chaque échantillon dans le puits en ligne A de la
plaque.
4. Positionner les peignes protecteurs des barreaux aimantés.
5. Placer les plaques dans l’automate.
6. Lancer le run d’extraction : Script AM_LSI_Express sur l’automate MagMAX™ Express.
7. A la fin du run d’extraction :
a. Transférer les éluâts contenus en ligne F de la plaque d’extraction dans la plaque de conservation des éluâts fournie dans le
kit ou dans des microtubes préalablement identifiés.
b. Jeter les autres consommables plastiques utilisés pour l’extraction (plaques, barrettes, peignes).
Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.