Thermo Fisher Scientific VetMAX Neospora caninum Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Neospora caninum

Taper: Mode d'emploi

VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Protocoles de puriﬁcation d’acide nucléique optimisés pour une utilisation avec le kit (réf. NEOSP)

Pub. nº MAN0011152 Rév. E.0

Espèces Matrices d’échantillons Type de test

Bovins

Petits ruminants (ovins, caprins) Tissus (encéphale, muscle cardiaque, avorté) Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les ﬁches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les ﬁches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermoﬁsher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit

disponibles sur thermoﬁsher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales,

nationales et/ou communautaires en vigueur.

■Objectif de ce guide ....................................................................................... 1

■Choix de l’échantillon ...................................................................................... 2

■Conservation des échantillons ............................................................................... 2

■Matériels requis non fournis ................................................................................. 2

■Instructions .............................................................................................. 4

■Préparation des échantillons pour la puriﬁcation ................................................................. 4

■Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode automatisée) ................ 5

■Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatisée) ............................ 8

■Puriﬁcation de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) .............................................. 9

■Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) ............................................. 11

■Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR ........................................................ 12

Annexe A Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL

■Matériels requis non fournis ................................................................................ 12

■Procédure de puriﬁcation .................................................................................. 13

Annexe B Documentation et support

■Assistance à la clientèle et support technique .................................................................. 13

■Garantie limitée du produit ................................................................................. 14

Objectif de ce guide

Ce guide décrit les protocoles de puriﬁcation d’acides nucléiques du Neospora caninum. Les méthodes ont été validées et optimisées

pour une utilisation en aval avec le Applied Biosystems™ VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit (N° Cat. NEOSP).

• La puriﬁcation automatisée des acides nucléiques est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher™ Flex, MagMAX™

Express-96, KingFisher™ mL ou KingFisher™ Duo Prime.

• La puriﬁcation manuelle d’acides nucléiques utilise des colonnes de centrifugation à base de silice.

GUIDE COMPLÉMENTAIRE

Pour usage en laboratoire.

Choix de l’échantillon

Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise

Tissus (encéphale, muscle cardiaque,

avorté) Individuel 20 à 25 mg de tissu

Conservation des échantillons

Type d’échantillon Conservation

Tissu (encéphale,

muscle cardiaque,

avorté)

Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 24 heures maximum après le

prélèvement).

Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation

dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme.

Matériels requis non fournis

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermoﬁsher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur

ﬁsherscientiﬁc.com ou auprès d'un autre principal fournisseur de laboratoire.

Les références catalogue qui s’achent sous forme de liens ouvrent les pages Web de ces produits.

Matériel nécessaire pour le prélèvement d’échantillon, la préparation et la puriﬁcation d’acides nucléiques

Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons

Article Source

Équipement

Poste de sécurité microbiologique de type II (PSMII) PFL

Centrifugeuse de paillasse PFL

Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL

Micropipettes de précision ajustables (gamme de 1 µl à 1 000 µl) PFL

Consommables

Embouts de pipettes résistant aux aérosols, sans nucléase PFL

Microtubes sans DNase/RNase de 1,5 ml et 2,0 ml PFL

Réactifs

5-IPC À partir du VetMAX™ Neospora caninum

Detection Kit (N° Cat. NEOSP)

Eau sans nucléase AM9932

PBS (1X), pH 7.4 PFL

Tableau 2 Matériels supplémentaires nécessaires pour la puriﬁcation des échantillons d’organes

Article Source

Équipement

Balance de précision PFL

Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL

Consommables

Boîte de Petri (stérile) PFL

2Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Matériel supplémentaire nécessaire pour la puriﬁcation automatisée d’acides nucléiques

Tableau 3 Matériel nécessaire pour la procédure MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit

Élément Source

Instrument, l’un des suivants :

KingFisher™ Flex Puriﬁcation System

Contacter votre représentant commercial

local.

MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor

KingFisher™ Duo Prime Puriﬁcation System

KingFisher™ mL Puriﬁcation System

Équipement

Bloc chauant à 55°C PFL

Réservoir de réactifs PFL

Consommables

Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent AB0626

Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 :

• KingFisher™ 96 Deep-Well Plate

• KingFisher™ 96 KF microplates

• KingFisher™ 96 tip comb for DW magnets

•95040450

•97002540

•97002534

Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 8 en page 12.

Kits et réactifs

MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit A32700 ou A32702

PBS, pH 7.4 (10X), exempt de RNase AM9624

Tableau 4 Matériel nécessaire pour le MagVet™ Universal Isolation Kit

Article Source

Instrument, l’un des suivants :

KingFisher™ Flex Puriﬁcation System

Contacter votre représentant commercial

local.

MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor

KingFisher™ mL Puriﬁcation System

Équipement

Bloc chauant à 70°C PFL

Réservoir de réactifs PFL

Kits et réactifs

MagVet™ Universal Isolation Kit MV384

MBL2 Buer 12143

Protéinase K (PK) • Qiagen 19131

• Macherey Nagel 740396

Éthanol à 80 % PFL

Matériel supplémentaire nécessaire pour la puriﬁcation manuelle d’acides nucléiques

Article Source

Équipement

Bloc chauant à 70°C PFL

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 3

Article Source

Kits et réactifs

L’un des kits suivants :

• QIAamp™ DNA Mini Kit

• Kit NucleoSpin™ Tissue

• Qiagen 51304

• Macherey Nagel 740952

Éthanol à 96-100 % PFL

Instructions

Préparer au moins un échantillon témoin puriﬁé à utiliser en tant que contrôle négatif d’extraction. Utiliser PBS (1X), pH 7.4 ou de

l’eau sans nucléase au lieu de l’échantillon testé, sauf indication contraire. Traiter l’échantillon témoin puriﬁé en même temps que les

échantillons testés, en utilisant le même protocole de puriﬁcation d’acides nucléiques.

Utiliser le 5-IPC qui est fourni avec le VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit. Ne pas utiliser le 5-IPC d’autres kits.

Préparation des échantillons pour la puriﬁcation

1. Hacher ﬁnement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide de pinces et d’un scalpel stériles.

2. Procéder à la puriﬁcation d’ADN avec 20 à 25 mg de tissu haché, en fonction du protocole de puriﬁcation utilisé.

•“Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode automatisée)” en page 5

•“Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatisée)” en page 8

•“Puriﬁcation de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle)” en page 9

•“Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle)” en page 11

4Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode

automatisée)

Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés :

• KingFisher™ Flex

• MagMAX™ Express-96

Suivre l’Annexe A, “Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés :

• KingFisher™ Duo Prime

• KingFisher™ mL

Méthode

Méthode MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit

Préparation des plaques pour le traitement

Préparation de la PK Solution

Traitement des échantillons avec la PK Solution

Mélanger les échantillons avec le mélange de Binding/Bead/IPC

Placement des échantillons dans l’instrument

Instructions

• Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger.

• Pour éviter toute contamination croisée :

– Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement.

– Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures.

• Pour éviter toute contamination par les nucléases :

– Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique

des nucléases présentes sur la peau.

– Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés

dans les récipients de réactifs.

– Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer.

Avant la première utilisation du kit

Téléchargement et installation du script

Le script adéquat pour le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation.

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 5

1. Sur la page internet du produit MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (à l’adresse thermoﬁsher.com, eectuer une

recherche à partir de la référence), faire déﬁler jusqu’à la section Documentation du produit.

2. Faire un clic droit sur le ﬁchier approprié pour télécharger la version la plus récente du script MagMAX_CORE pour votre instrument.

Tableau 5 Scripts recommandés

Instrument Nom du script

KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex.bdz

KingFisher™ 96

MagMAX™ Express-96

MagMAX_CORE_KF-96.bdz

KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz

KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz

Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chaue pas le liquide lors de l’étape d’élution.

Tableau 6 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauée

Instrument Nom du script

KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz

KingFisher™ 96

MagMAX™ Express-96

MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz

KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz

KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz

3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter l’assistance technique pour connaître les instructions d’installation du

script.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

1.1. Préparation des plaques pour le traitement.

Tableau 7 Conﬁguration de la plaque : Instrument KingFisher™ Flex ou MagMAX™ Express-96

ID de la

plaque Position de la

plaque[1] Type de

plaque Réactif Volume par

puits

Plaque de

lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Plaque de

lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque.

[1] Position sur l’instrument.

Remarque : Pour conﬁgurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher™

Duo Prime ou KingFisher™ mL, voir Annexe A, “Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo

Prime ou KingFisher™ mL”.

1.2. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une

feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument.

1Préparation des plaques

pour le traitement

6Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Remarque : Préparer la PK Solution immédiatement avant utilisation.

2.1. Mélanger les composants suivants (dans l’ordre indiqué) pour le nombre requis d’échantillons,

plus 10 % d’excédent (recommandé).

Composant Volume par échantillon

PBS (1X), pH 7.4 200 μl

MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl

PK Solution totale 210 μl

2.2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le

contenu au fond du tube.

2Préparation de la PK

Solution

3.1. Ajouter les composants suivants dans une centrifugeuse de paillasse de 2 ml.

• Tissu haché : 20 à 25 mg

• MagMAX™ CORE Lysis Solution : 200 µl

3.2. Vortexer vigoureusement pendant 10 secondes.

3.3. Centrifuger brièvement.

3.4. Passer immédiatement à l’étape suivante.

3Préparation de

l’échantillon

Suivre cette procédure dans des tubes individuels pour éviter la contamination. Ne pas utiliser de

plaques.

4.1. Ajouter 210 µl de PK Solution directement au lysat.

4.2. Vortexer vigoureusement pendant 10 secondes, puis centrifuger brièvement pour que le contenu

soit au fond du tube.

4.3. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 70°C (recommandé).

Autre approche, incuber l’échantillon pendant 2 heures à 55°C.

4.4. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube.

4Traitement des

échantillons avec la PK

Solution

5.1. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon (jusqu’à 410 μL) dans les puits

appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes.

5.2. Vortexer soigneusement les MagMAX™ CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont

complètement resuspendues.

5.3. Préparation du mélange de Binding/Bead/IPC : mélanger les composants suivants pour le

nombre requis d’échantillons, plus 10 % d’excédent (recommandé).

Composant Volume par échantillon

MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl

MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl

5-IPC 5 μl

Mélange de Binding/Bead/IPC total 425 µl

5.4. Homogénéiser le mélange de Binding/Bead/IPC par inversion jusqu’à ce que la solution soit

homogène, puis ajouter 425 μl du mélange de Binding/Bead/IPC dans chaque échantillon.

5.5. Procéder immédiatement au traitement des échantillons dans l’instrument (section suivante).

5Mélanger les

échantillons avec

le mélange de

Binding/Bead/IPC

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 7

6.1. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script”

en page 5).

6.2. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque

l’instrument vous invite à le faire.

Conserver l’acide nucléique puriﬁé sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois

maximum, ou à -80°C pour une conservation à long terme.

6Placement des

échantillons dans

l’instrument

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec le MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatisée)

Le protocole suivant peut être utilisé avec les instruments KingFisher™ Flex, KingFisher™ mL et MagMAX™ Express-96.

Avant la première utilisation du kit

Remarque : Les produits PK et MBL2 Buer doivent être commandés séparément du kit.

• Préparation du tampon de lyse NM1 Buer : ajouter 100 ml de tampon N1 Buer dans la bouteille contenant le tampon M1 Buer

(25 ml), puis vortexer pour bien mélanger.

Conserver le tampon de lyse NM1 Buer à température ambiante jusqu’à 1 an.

• Reconstitution de la PK : suivre les recommandations du fournisseur.

Avant chaque utilisation du kit

Préparer le mélange MBL2+Beads : mélanger les composants suivants pour le nombre d’échantillons requis, plus 5 à 10 % d’excédent,

puis vortexer aﬁn de bien mélanger.

Composant Volume par échantillon

MBL2 Buer 500 µl

NM_LSI_Beads 20 µl

Éliminer le mélange MBL2+Beads après utilisation.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

1.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape

suivante.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé 20 mg de tissu haché –

Eau sans nucléase – 200 µl

Protéinase K • Qiagen : 20 µl

• Macherey Nagel : 25 µl

• Qiagen : 20 µl

• Macherey Nagel : 25 µl

Tampon de lyse NM1 280 µl 280 µl

5-IPC 5 µl 5 µl

1.2. Vortexer pendant 1 minute.

1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes.

1Traitement du lysat avec

la PK

8Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Préparer les plaques ou barrettes de tubes pour le traitement à l’extérieur de l’instrument comme

décrit dans le tableau suivant.

Position[1] Type de plaque[2] Réactif Volume par puits

2 Deep Well NM3 Wash Buer 600 µl

3 Deep Well NM4 Wash Buer 600 µl

4 Deep Well Éthanol à 80 % 600 µl

5 Standard Tampon d’élution NM6 200 µl

6 Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque ou la

barrette de tubes.

[1] Position sur l’instrument.

[2] Non applicable en cas d’utilisation de barrettes de tubes.

2Préparation des plaques

ou barrettes de tubes

pour le traitement

3.1. Une fois l’incubation terminée, centrifuger les échantillons brièvement pour faire diminuer la

condensation.

3.2. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon jusqu’à dans les puits appropriés de la

plaque d’échantillons ou la barrette de tubes.

3.3. Vortexer vigoureusement le mélange MBL2+Beads pour s’assurer que les billes sont

complètement resuspendues.

3.4. Ajouter 520 µl de mélange MBL2+Beads pour chaque échantillon et contrôle.

3.5. Sélectionner le script approprié sur l’instrument.

• KingFisher™ Flex/MagMAX™ Express-96 : NM_LSI_RRC96

• KingFisher™ mL : NM_LSI_15prep

3.6. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque

l’instrument vous invite à le faire.

Charger la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes à la position 1 sur l’instrument.

Remarque : Si vous utilisez l’instrument KingFisher™ mL, charger le peigne et toutes les

barrettes de tubes en même temps. L’instrument ne vous invite pas à charger les éléments

individuellement.

3.7. À la ﬁn du test, lorsque l’instrument le demande, retirer la plaque ou les tubes contenant l’acide

nucléique puriﬁé.

Instrument Procédure

• KingFisher™ Flex

• MagMAX™ Express-96

Enlever la plaque en position 5 puis couvrir d’un ﬁlm adhésif.

KingFisher™ mL Enlever la barrette de tubes et transférer l’acide nucléique puriﬁé en

position 5 dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse.

Conserver les acides nucléiques puriﬁés entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en

dessous de -16°C pour une conservation à long terme.

3Placement des

échantillons dans

l’instrument

Puriﬁcation de l’ADN avec le QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle)

Avant la première utilisation du kit

Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buers : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du

fournisseur.

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 9

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

1.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape

suivante.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé 20 mg de tissu haché –

Eau sans nucléase – 200 µl

ATL Buer 180 µl 180 µl

Protéinase K 20 μl 20 μl

5-IPC 5 µl 5 µl

1.2. Vortexer pendant 1 minute.

1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement lysé.

1.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la

condensation.

1.5. Ajouter 200 µl d’AL Buer, puis vortexer pendant 15 secondes.

1.6. Incuber à 70°C pendant 10 minutes.

1.7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement.

1.8. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes,

puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu.

1Lyse et

homogénéisation des

échantillons

2.1. Insérer une colonne QIAamp™ DNA Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du

volume de l’échantillon dans la colonne.

2.2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 15 000 × g pendant 1 minute.

2.3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

2Liaison de l’ADN à la

colonne

3.1. Ajouter 500 μl d’AW1 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g

pendant 1 minute.

3.2. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

3.3. Ajouter 500 μl d’AW2 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à 15 000 × g

pendant 1 minute.

3.4. Jeter le tube collecteur, puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

3.5. Centrifuger à 15 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane.

3.6. Jeter le tube collecteur.

3.7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl d’AE Buer.

3.8. Boucher la colonne, puis incuber à température ambiante pendant 1 minute.

3.9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne.

L’ADN puriﬁé se trouve dans le microtube.

Conserver l’ADN puriﬁé entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour

une conservation à long terme.

3Lavage et élution de

l’ADN

10 Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle)

Avant la première utilisation du kit

• Reconstitution du tampon B5 Buer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur.

• Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PB Buer selon les recommandations du fournisseur.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

1.1. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape

suivante.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé 20 mg de tissu haché –

Eau sans nucléase – 200 µl

T1 Buer 180 µl 180 µl

Protéinase K 25 µl 25 µl

5-IPC 5 µl 5 µl

1.2. Vortexer pendant 1 minute.

1.3. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement lysé.

1.4. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire descendre la

condensation.

1.5. Ajouter 200 µl de B3 Buer, puis vortexer pendant 15 secondes.

1.6. Incuber à 70°C pendant 10 minutes.

1.7. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement.

1.8. Ajouter 200 µl d’éthanol à 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes,

puis centrifuger brièvement pour rassembler le contenu.

1Lyse et

homogénéisation des

échantillons

2.1. Insérer une colonne de kit NucleoSpin™ Tissue dans un tube collecteur, puis transférer la totalité

du volume de l’échantillon dans la colonne.

2.2. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 11 000 × g pendant 1 minute.

2.3. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

2Liaison de l’ADN à la

colonne

3.1. Ajouter 500 μl de tampon BW Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

11 000 × g pendant 1 minute.

3.2. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

3.3. Ajouter 600 μl de tampon B5 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

11 000 × g pendant 1 minute.

3.4. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

3.5. Centrifuger à 11 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane.

3.6. Jeter le tube collecteur.

3Lavage et élution de

l’ADN

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 11

3Lavage et élution

de l’ADN (suite)

3.7. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon

BE Buer.

3.8. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute.

3.9. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne.

L’ADN puriﬁé se trouve dans le microtube.

Conserver l’ADN puriﬁé entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour

une conservation à long terme.

Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR

• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.

– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits ampliﬁés ou

préparer des échantillons.

• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible.

• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des fournitures dédiés pour les étapes suivantes :

– Préparation des échantillons et conﬁguration de la réaction.

–Ampliﬁcation et analyse des produits.

• Ne pas introduire les produits ampliﬁés dans la zone pré-PCR de la réaction.

• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols.

• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible.

• Utiliser une pipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols.

• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de

décontamination ADN.

Annexe A Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL

Suivre cette procédure pour la puriﬁcation avec le MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit à l’aide de l’instrument KingFisher™ Duo

Prime ou KingFisher™ mL.

Matériels requis non fournis

Tableau 8 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL

Article Source[1]

Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime

KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes

d’élution pour 96 échantillons) 97003530

KingFisher™ Duo Elution Strip (pack de 40)[2] 97003520

KingFisher™ Duo Peigne à 12 pointes pour plaque Microtiter 96 Deepwell (pack de 50)[2] 97003500

KingFisher™ Flex Microtiter Deep-Well 96 plates[2] 95040460

Consommables pour l’instrument KingFisher™ mL

KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141

KingFisher™ mL Peigne (800 unités) 97002111

KingFisher™ mL Tube (20 x 45 unités) 97002121

[1] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre

principal fournisseur de laboratoire.

[2] Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (Réf. 97003530).

12 Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit

Procédure de puriﬁcation

Remarque : Pour la réalisation de cette procédure pour un traitement sur l’instrument KingFisher™ mL, mélanger les échantillons par

aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument.

1. Suivre le protocole, de la préparation du broyat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse.

Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons.

2. Ajouter la MagMAX™ CORE Wash Solution 1, la MagMAX™ CORE Wash Solution 2 et le MagMAX™ CORE Elution Buer aux

positions indiquées, selon votre instrument.

Tableau 9 Conﬁguration de la plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime

ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits

Échantillon A Deep Well Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon

Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution[1] Barrette de tubes

séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne H Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque.

[1] S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution.

[2] Placée sur l’élément chauffant.

Tableau 10 Conﬁguration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL

ID de la position Position de la

barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits

Échantillon 1 Standard Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon

Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne S.o. S.o. Glisser le peigne dans le support pour peigne.

3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 5).

4. Démarrer le test, puis charger en même temps les plaques ou les barrettes de tubes préparées dans l’instrument. L’instrument ne

vous invite pas à charger les éléments individuellement.

Conserver l’acide nucléique puriﬁé sur de la glace pour une utilisation immédiate, à –20°C pendant 1 mois au maximum ou à –80°C pour

un stockage à long terme.

Annexe B Documentation et support

Assistance à la clientèle et support technique

Visiter thermoﬁsher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support.

• Numéros de téléphone de contact internationaux

• Informations sur le support produit

– FAQ relatives aux produits

– Logiciels, correctifs et mises à jour

– Formations sur de nombreux instruments et applications

• Commandes et assistance en ligne

• Documentation produit

– Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

–Certiﬁcats d’analyse

– Fiches de données de sécurité (FDS)

Guide complémentaire du VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit 13

Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers.

Garantie limitée du produit

Life Technologies Corporation et ses ﬁliales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles

sur le site www.thermoﬁsher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre

contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermoﬁsher.com/support.

Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modiﬁées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ: DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES

POUR RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE

OU EN RÉSULTANT.

Traduit de l’anglais, depuis la publication numéro MAN0011150, révision E.0.

Historique des révisions: Pub. n° MAN0011150

Révision Date Description

E.0 11 août 2021

Ajout de l’IPC aux protocoles suivants :

• MagVet™ Universal Isolation Kit

• QIAamp™ DNA Mini Kit

• Kit NucleoSpin™ Tissue

D.0 28 janvier 2021

• Ajout du protocole du MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit.

•Modiﬁcations mineures de la formulation et de la mise en page pour plus de cohérence avec les documents connexes.

C.0 24 juillet 2018 Mise à jour du modèle de document actuel, avec les mises à jour associées de la garantie, des marques et des logos.

B.0 3 août 2015 Correction du volume du MBL2 Buer.

A.0 7 avril 2015 Nouveau document.

Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions

générales de toutes les licences à usage limité.

QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH. NucleoSpin est une marque de MACHEREY‑NAGEL.

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2 Décembre 2021