Thermo Fisher Scientific PrioCHECK L. Hardjo Ab Strip Kit Mode d'emploi

Marque
Thermo Fisher Scientific
Modèle
PrioCHECK L. Hardjo Ab Strip Kit
Taper
Mode d'emploi
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
NOTICE D’UTILISATION
PrioCHECK™ L. Hardjo Ab Strip Kit
Test ELISA pour la détection
in vitro
des anticorps spécifiques de
Leptospira interrogans
serovar Hardjo
dans le sérum et le lait de vache
Référence Catalogue 7442080
MAN0013804 Rév. A.0
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des
vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit disponibles sur
thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Introduction
La leptospirose est une maladie contagieuse qui affecte les animaux et les humains et dont l'agent est un spirochète du genre Leptospira. Le genre Leptospira
est actuellement divisé en 2 espèces : L. interrogans (pathogène) et L. biflexa (saprophyte). Il semble qu'il y ait en général une spécificité d'hôte pour les
sérovars de Leptospira, en revanche les animaux et les humains peuvent être infectés par une grande variété de sérovars différents. La leptospirose est une
maladie cosmopolite. Dans beaucoup de pays européens, Leptospira interrogans serovar Hardjo (L. Hardjo) est l'agent le plus souvent responsable de la
leptospirose bovine. La technique ELISA indirecte décrite par Bercovich et al a été modifiée pour donner un test ELISA sensible, spécifique et fiable, adapté
au dépistage à grande échelle. Applied Biosystems™ PrioCHECK™ L. Hardjo Ab Strip Kit peut être utilisé pour : Les programmes d'éradication de
L. Hardjo ; La surveillance du statut d'indemne d'infection à L. Hardjo pour les troupeaux de bovins; La surveillance du taux des anticorps anti-L. Hardjo
chez les bovins après vaccination; Le diagnostic individuel ou à l'échelle du troupeau.
Principe du test
PrioCHECK™ L. Hardjo Ab Strip Kit est un ELISA indirect qui détecte les
anticorps dirigés contre Leptospira interrogans serovar Hardjo (L. Hardjo)
chez les bovins. De l'antigène inactivé est coaté dans une microplaque. Les
échantillons de sérum et/ou de lait sont distribués dans les puits coatés de
la microplaque. Les anticorps anti–L Hardjo présents dans l'échantillon se
lient à l'antigène pendant l'incubation. Les anticorps fixés sont ensuite
détectés grâce à un anticorps monoclonal anti-bovin conjugué à la peroxy-
dase de raifort. Le substrat chromogène (TMB) est ensuite ajouté, puis la
coloration est stoppée et la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm.
Composition du coffret
Coffret de 5 plaques pour 440 échantillons. Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à
la date d’expiration qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de
conservation des produits du coffret, une fois dilués, ouverts ou
reconstitués, est mentionnée au chapitre s'y référant (voir ci-dessous).
Composant
Description
1 : Microplaque
Cinq microplaques conditionnées sous vide partiel dans
des sachets contenant un déshydratant.
2 : Conjugué (30x)
Concentré 30x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 2.5 mL de conjugué. Le conjugué dilué n’est pas
stable, préparer juste avant utilisation.
3 : Tampon de dilution
(5x)
Concentré 5x, à diluer avant utilisation). Un flacon
contenant 60 mL de tampon de dilution. Stabilité du
tampon de dilution solution de travail : 4 heures à 22±3°C.
4 : Sérum de cheval
Lyophilisé. Un flacon contenant 3.5 mL de sérum de cheval
lyophilisé. Stabilité du sérum de cheval reconstitué :
jusqu’à la date de péremption à −20°C.
5 : Eau déminéralisée
Un flacon contenant 10 mL d'eau déminéralisée.
6 : Solution de lavage
(200x)
Concentrée 200x, à diluer avant utilisation. Un flacon
contenant 60 mL de solution de lavage. Stabilité de la
solution de lavage : 1 semaine à 22±3°C.
7 : Sérum de contrôle 1
Lyophilisé. Un flacon contenant 0.5 mL de sérum de
contrôle 1 (sérum de contrôle positif). Stabilité sérum
reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C.
8 : Sérum de contrôle 2
Lyophilisé. Un flacon contenant 0.5 mL de sérum de
contrôle 2 (sérum de contrôle négatif). Stabilité sérum
reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C.
9 : Sérum de contrôle 3
Lyophilisé. Un flacon contenant 0.5 mL de sérum de
contrôle 3 (sérum de contrôle positif faible). Stabilité
sérum reconstitué : jusqu’à la date de péremption à −20°C.
10 : Substrat
chromogène (TMB)
Prêt à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de substrat
chromogène (TMB).
11 : Solution d'arrêt
Prête à l'emploi. Un flacon contenant 60 mL de solution
d'arrêt.
Autres composants du
coffret
• Notice d'utilisation
• 10 films adhésifs pour couvrir les plaques
Equipement nécessaire mais non fourni
Use
Description(1)
Microplaques
non
sensibilisées
Microplaques non sensibilisées pour effectuer les pré-dilutions des
échantillons de lait et de sérum. Nous conseillons l'utilisation de
plaques à fond rond (Réf. 267245). Mais d'autres plaques ou tubes (dont
la paroi ne fixe pas les complexes immuns) peuvent être utilisés.
Général
Equipement de laboratoire aux normes de sécurité nationales.
Analyse des
résultats
Lecteur de microplaques : Multiskan EX ou équivalent. Le lecteur doit
être équipé d'un filtre permettant de lire les plaques à 450 nm.
Optionnel
Laveur de microplaques.
(1) Sauf indication, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.
Mode opératoire
Précautions
• Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon stricte.
• PrioCHECK™ L. Hardjo Ab Strip Kit ne doit être réalisé que dans les
laboratoires équipés pour cela.
• Les échantillons doivent être considérés comme potentiellement
infectieux. Tout matériel en contact avec ces échantillons doit être
considéré comme potentiellement contaminé.
Remarques
Pour obtenir des résultats optimums avec PrioCHECK™ L. Hardjo Ab Strip
Kit, les précautions suivantes doivent être prises :
• Le mode opératoire doit être rigoureusement suivi.
• Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à T° ambiante (22±3°C)
avant utilisation.
• L'embout des pipettes doit être changé chaque fois qu'un nouvel
échantillon ou réactif est prélevé.
• Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour chaque réactif.
• Les composants du coffret ne doivent pas être utilisés après la date de
péremption ou si un changement dans leur aspect est observé.
• Les réactifs provenant de coffrets portant des numéros de lots
différents, ne doivent pas être associés dans une même série de tests.
• Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée ou une eau équivalente.
Solutions à préparer à l'avance
Tampon de dilution solution de travail
Le tampon de dilution (Composant 3) concentré (5x) doit être dilué au 1:5
(1 volume de tampon de dilution concentré + 4 volumes d'eau déminéralisée).
Sérum de cheval
Ramener le flacon à 22±3°C et reconstituer le sérum de cheval (Composant 4)
avec 3.5 mL de l'eau déminéralisée (Composant 5). Le sérum de cheval
reconstitué peut être conservé à −20°C jusqu’à la date de péremption.
Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :
1. Ramener le flacon à 22±3°C.
2. Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour
s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.
3. Ouvrir le flacon.
4. Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée (voir l'étiquette du flacon).
5. Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le
lyophilisat soit entièrement dissout.
6. Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.
7. Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la
formation de mousse).
Tampon ELISA
Diluer le sérum de cheval reconstitué au 1:100 dans le tampon de dilution
solution de travail; Pour une plaque, préparer 40 mL (ajouter 400 µL de
sérum de cheval reconstitué + 39.6 mL de tampon de dilution solution de
travail). Tampon ELISA peut être conserve 4 heures à 22±3°C.
Dilution du conjugué
Diluer le Conjugué (30x) (Composant 2) au 1/30 dans le tampon de dilution
solution de travail; Pour une plaque, préparer 12 mL (ajouter 400 µL
conjugué à 11.60 mL tampon de dilution solution de travail).
Remarque : La dilution de travail du conjugué doit être préparée juste
avant utilisation.
Sérums de contrôle
Reconstituer les sérums de contrôle (Composant 7−9) avec 0.5 mL de l'eau
déminéralisée (Composant 5). Les sérums de contrôle reconstitués doivent
être de préférence aliquotés et conservés à −20°C jusqu’à la date de péremp-
tion. Mélanger délicatement le sérum après décongélation, ne pas recongeler.
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15 janvier 2019
Solution de lavage
La solution de lavage (200x) (Composant 6) doit être diluée 1:200 dans de
l'eau déminéralisée. La quantité fournie permet de préparer un volume
final de 12 litres. Stabilité de la solution de lavage : 1 semaine à 22±3°C.
Remarque : Voir Annexe B pour la préparation et la conservation des
échantillons.
Pré-traitement de la plaque de réaction
Remarque : Le pré-traitement de la plaque de réaction est nécessaire
uniquement lorsque des échantillons de lait sont testés et non lorsqu'il
s'agit de sérums. Les sérums peuvent être testés sur une microplaque pré-
traitée (cela n'a pas d'effet sur les résultats).
1. Distribuer 100 µL de tampon ELISA dans les puits de la microplaque
(Composant 1).
2. Couvrir la plaque avec un film adhésif ou avec un couvercle et l'incuber
60±2 minutes à 37±1°C.
3. Rejeter le tampon ELISA et laver la plaque 6 fois avec la solution de lavage.
Pré-dilution des sérums de contrôle et des échantillons de sérum
• Faire une dilution au 1:20 pour les sérums de référence 1, 2, 3 ainsi que
pour l’échantillon à tester dans une plaque vierge en mélangeant 10 µL
de sérum avec 190 µL de tampon ELISA.
Incubation des échantillons
1. Si des échantillons de sérum sont testés, déballer le nombre de plaques
requises. Si des échantillons de lait sont testés, utiliser les plaques
comme décrit dans le « Pré-traitement de la plaque de réaction ».
2. Distribuer 100 µL de tampon ELISA dans les puits A1 et B1 (blancs) de
la plaque de barrettes.
3. Distribuer 90 µL de tampon ELISA dans les puits C1 à H1.
4. Distribuer 10 µL de sérum de contrôle 1 dilué au 1:20 (= contrôle
positif) dans les puits C1 et D1 de la plaque. Dilution finale : 1:200.
5. Distribuer 10 µL de sérum de contrôle 2 dilué au 1:20 (= contrôle
négatif) dans les puits E1 et F1 de la plaque. Dilution finale : 1:200.
6. Distribuer 10 µL de sérum de contrôle 3 dilué au 1:20 (= contrôle positif
faible) dans les puits G1 et H1 de la plaque. Dilution finale : 1:200.
7. Pour les Echantillons de sérum, distribuer 90 µL de tampon ELISA
dans les puits vides de la plaque. Transférer 10 µL de chaque
échantillon pré-dilué 1:20 de la plaque non sensibilisée vers les puits
appropriés (dilution finale : 1:200.) selon le plan de plaque établi (par
ex. le sérum 1 en A2, le sérum 2 en B2, etc.). Les échantillons de sérums
peuvent être titrés en faisant une deuxième série de dilutions dans du
tampon de dilution.
8. Pour le Lait individuel distribuer 75 µL de tampon ELISA dans les puits
vides de la plaque. Distribuer 25 µL de chaque échantillon de lait
(dilution finale : 1:4) selon le plan de plaque établi (par ex., l'échantillon 1
en A2, l'échantillon 2 en B2, etc.). Prendre le lait dégraissé sous la couche
de crème.
9. Pour le Lait de tank distribuer 100 µL de chaque échantillon de lait
dans les autres puits vides de la plaque de barrettes, selon le plan de
plaque établi (par ex. l'échantillon 1 en A2, l'échantillon 2 en B2, etc.)
Prendre le lait dégraissé sous la couche de crème.
10. Couvrir et agiter doucement la plaque de barrettes, puis l'incuber
60±5 minutes à 37±1°C.
Incubation avec le conjugue et avec le substrat chromogène (TMB)
1. Laver la plaque 6 fois avec la solution de lavage diluée.
2. Distribuer 100 µL de conjugué dilué dans tous les puits.
3. Couvrir la plaque et l'incuber 60±5 minutes à 37±1°C.
4. Laver la plaque 6 fois avec la solution de lavage diluée.
5. Distribuer 100 µL de substrat chromogène (TMB) dans tous les puits.
6. Incuber la plaque 15 minutes à 22±3°C.
7. Ajouter 100 µL de solution d'arrêt (Composant 11).
8. Homogénéiser doucement le contenu des puits avant de mesurer la
densité optique (DO).
Remarque : Commencer à ajouter la solution d'arrêt 15 minutes après avoir
distribué le substrat chromogène (TMB). Distribuer la solution d'arrêt dans
tous les puits en gardant le même ordre et le même rythme que pour
distribuer le substrat chromogène (TMB).
Lecture du test et calcul des résultats
1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450 nm dans les 15 minutes
suivant l'addition de la solution d'arrêt.
2. Calculer la DO450 moyenne du blanc (puits A1 et B1).
3. Calculer la DO450 corrigée de tous les échantillons en soustrayant la
DO450 blanc.
4. Calculer le pourcentage de positivité (PP) des sérums de contrôle 2 et 3
et des échantillons selon la formule ci-dessous.
La DO450 corrigée des échantillons est exprimée en pourcentage de
positivité (PP) par rapport à la DO450 moyenne corrigée du sérum de
contrôle 1 (puits C1 et D1).
PP = (DO450 corrigée échantillon / DO450 corrigée sérum de contrôle 1) × 100
Interprétation des résultats
Validation des critères
1. La DO450 blanc moyenne (puits A1 et B1) doit être <0.150.
2. La DO450 corrigée du sérum de contrôle 1 (puits C1 et D1) doit
être ≥1.000.
3. Le PP du sérum de contrôle 2 doit être <20.
4. Le PP du sérum de contrôle 3 doit être compris entre 20 et 60.
Si les critères ci-dessus ne sont pas remplis les résultats sont ininterprétables.
Remarque : Si la DO450 moyenne corrigée du sérum de contrôle 1 est
inférieure à 1.000, de substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide
au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la solution de
substrat à 22±3°C avant utilisation ou incuber plus longtemps la plaque
(sans dépasser 30 minutes d'incubation).
Interprétation du pourcentage de positivité
Echantillons de sérum
PP <20% Négatif
Absence d'anticorps spécifiques de
L.
Hardjo dans le
prélèvement.
PP = 20%−45% Douteux
Le prélèvement peut contenir des anticorps spécifiques
de
L.
Hardjo.
PP >45% Positif
Présence d'anticorps spécifiques de
L.
Hardjo dans le
prélèvement.
Echantillons de lait (individuel ou de tank)
PP <40% Négatif
Absence d'anticorps spécifiques de
L.
Hardjo dans le
prélèvement.
PP = 40%−60% Douteux(1)
L'échantillon peut contenir des anticorps spécifiques de
L.
Hardjo.
PP >60% Positif
Présence d'anticorps spécifiques de
L.
Hardjo dans le
prélèvement.
(1)
Les échantillons de lait douteux doivent être retestés avec PrioCHECK
™
L.
Hardjo Ab Strip Kit.
Lorsqu'un résultat douteux est confirmé, il est utile de rechercher les anticorps spécifiques
dans le sérum des animaux du troupeau suspecté d'infection à
L.
Hardjo.
Remarque : Les seuils de la technique doivent être redéfinis en fonction de
la situation locale, de manière à obtenir un pourcentage acceptable de faux
positifs et de faux négatifs. Il est préférable de tester des sérums individuels
(dilution : 1:200) plutôt que des échantillons de lait individuels
(dilution : 1:4) à cause des réactions non spécifiques qui peuvent survenir
lorsque l'on teste des échantillons de lait individuels.
Annexe A – Références bibliographiques
1. International Leptospirosis Society, First meeting, Nantes, France
9−12 September 1996.
2. OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Third Edition, 1996.
3. Bercovich, Z, Taaijke, R and Bokhout, BA. Vet. Microbiol. 21, 255−262, 1990.
Annexe B – Préparation et conservation des échantillons
Sérums
Lait
• Les sérums
peuvent être
conservés à
−20°C avant
d'être testés.
• Les sérums
doivent être pré-
dilués dans le
tampon ELISA.
• Les échantillons de lait peuvent être conservés à 5±3°C avant
d'être testés. Si les échantillons de lait ne sont pas testés dans
les 3 jours qui suivent leur recueil, ajouter 0.02% d'azide de
sodium comme conservateur.
• Les échantillons de lait à tester doivent être recueillis en
effectuant le prélèvement sous la couche de crème qui
recouvre le lait.
• Lait (de tank) : non dilué.
•
Lait individuel : dilution finale au 1:4 dans le tampon ELISA.
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux dernières
nouveautés relatives aux services et à l'assistance technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches
Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits
chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits
selon les termes et conditions générales de ventes disponibles sur le site
www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous
avez des questions, vous pouvez prendre contact avec Life Technologies à
l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.
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Historique des révisions : Pub. N° MAN0013804 (français)
Rév.
Date
Description
A.0 15 janvier
2019
Nouveau document. Conversion effectuée du document existant
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