Thermo Fisher Scientific VetMAX FIP Dual IPC Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX FIP Dual IPC Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ FIP Dual IPC Kit

RT-PCR temps réel TaqMan® pour la détection des coronaires félins responsables de la Péritonite

Infectieuse Féline

Référence Catalogue PIFP50

Partie Nº 100020408 Pub. Nº MAN0008841 Rév. B.0

Technique

Espèce(s) Acides nucléiques isolés à partir des matrices Test

RT-PCR temps réel (ARN)

–Duplex

–IPC endogène ou exogène

Félins

Sang en tube EDTA

Fèces

Ecouvillons de selles

Ascites (épanchements de l’abdomen ou du thorax)

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ FIP Dual IPC Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection par RT- PCR temps

réel des coronaires félins responsables de la Péritonite Infectieuse Féline (PIF).

Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ARN viral du coronavirus félin et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control) endogène ou exogène. La

positivité de l’IPC traduit à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ARN viraux extraits à partir de sang en tube EDTA, de feces, d’ecouvillons de selles et d’ascites.

Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande auprès du Support

Technique.

Réactifs du kit et conservation

Le VetMAX™ FIP Dual IPC Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en duplex du

coronavirus félin et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. Après

première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :

Composant Description Volume

(50 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

3 - Mix PIF

(Tube vert)

Mix pour RT-PCR TaqMan

. Contient :

•Le système de détection pour la cible PIF, comprenant une sonde

TaqMan® marquée FAM™ - NFQ (Non-Fluorescent Quencher).

•Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde TaqMan®

marquée VIC™ - TAMRA™.

•Le tampon, la reverse-transcriptase et l’enzyme de PCR temps réel.

2 × 500 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

4a - EPC PIF

(Tube marron)

External Positive Control :

Contrôle positif en coronavirus félin. Il s’agit d’acides nucléiques déjà

extraits à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

90 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

5 - IPC PIF

(Tube jaune)

Internal Positive Control :

Contrôle interne exogène, à ajouter dans chaque échantillon (non

cellulaires - fèces, écouvillons, et ascites) et chaque témoin lors de

l’étape de lyse de l’extraction.

250 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

NOTE : Pour de petites séries d’extraction, il est conseillé d’aliquoter l’IPC PIF à la première utilisation, afin d’éviter plus de 3 cycles de

congélation-décongélation (sous un volume minimum de 50 µL).

Témoins d’extraction et d’amplification

Le VetMAX™ FIP Dual IPC Kit contient 2 témoins permettant la validation de l’extraction et de l’amplification des ARN viraux :

4a - EPC PIF : contrôle positif en PIF

Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible PIF par RT-PCR temps réel.

2 VetMAX™ FIP Dual IPC Kit Notice d’Utilisation

5 - IPC PIF : contrôle interne d’extraction

Contrôle positif à ajouter dans chaque échantillon (non cellulaire et fèces) lors de l’étape de lyse de l’extraction des acides nucléiques.

Dans le cas des échantillons cellulaires (sang), la validation de l’extraction des acides nucléiques s’effectue grâce à la détection d’un IPC

endogène (Internal Positive Control), présent dans chaque échantillon cellulaire.

Un résultat IPC positif avec une valeur conforme dans un échantillon cellulaire (cas d'un IPC endogène) ou comprise dans l’intervalle

accepté de Ct dans un échantillon non cellulaire ou de fèces (cas d'un IPC exogène) permet de valider l’extraction d'un échantillon qu’il

soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques (avec ou sans ajout d'IPC selon le type d'échantillon) puis RT-PCR temps réel.

Un résultat négatif en PIF et en IPC endogène (cas des échantillons cellulaires) permet de valider le bon déroulement de la lyse et

l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la RT-PCR temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Un résultat négatif pour la cible PIF et l’IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des réactions

pour la RT-PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),

microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la RT-PCR temps réel est de 25 µL :

• 3 - Mix PIF : 20 µL par analyse

• ARN extrait : 5 µL par analyse

Extraction des ARN viraux

Il est nécessaire d’isoler les ARN à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.

Dans le cas des échantillons non cellulaires et de fèces, ajouter 5 µL de 5 - IPC PIF par échantillon à extraire et au NCS lors de l’étape de

lyse de l’extraction des acides nucléiques.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ FIP Dual IPC Kit, merci de contacter le

Support Technique.

Préparation de la RT-PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres échantillons.

2. Décongeler le tube 3 - Mix PIF entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser le tube 3 - Mix PIF par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix PIF par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Ajouter les ARN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant

Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ARN extraits de l’échantillon 5 µL

Contrôle positif d’amplification

4a - EPC PIF

5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS)

NCS extrait 5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free

5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

VetMAX™ FIP Dual IPC Kit Notice d’Utilisation 3

Amplification par RT-PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

PIF

FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

IPC PIF

VIC™ TAMRA™(1)

Référence passive : ROX

™(1)

(1) Les fluorophores TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par RT-PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les

détecter. Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par RT-PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur PIF et le détecteur IPC PIF dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1

×1 45°C 10 minutes

Etape 2

×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×45 95°C 15 secondes

60°C(1) 45 secondes

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 45 secondes.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la RT-PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les

recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur PIF Détecteur IPC PIF Validation

EPC PIF

Ct = Ct QC PIF de 4a- EPC PIF ± 3Ct(1) Ct < 45 ou Ct > 45(2) RT-PCR validée

NCS Ct > 45

Si IPC Endogène détecté :

> 45

Extraction validée

Si ajout d’IPC Exogène :

= C

IPC de 5 - IPC PIF ± 3C

t(3)

Ct > 45 Ct > 45 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

(3) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.2 « IPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur PIF

Détecteur IPC PIF

Interprétation

IPC endogène

(sang total)

IPC exogène

(ascite, fèces, écouvillon)

< 45

Ct < 45 ou Ct > 45 Ct < 45 ou Ct > 45 PIF détectée

> 45

Ct < 45 Ct ≤ Ct IPC du NCS + 3Ct(1) PIF non détectée

> 45

Ct > 45 Ct > Ct IPC du NCS + 3Ct(1) Non validé(2)

(1) Se référer à la valeur de Ct IPC obtenue pour le NCS réalisé lors d’une même série d’extraction que les échantillons à analyser. La valeur du Ct IPC obtenue

pour ce NCS doit préalablement être validée comme décrit précédemment.

(2) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.

thermofisher.com/support

thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

31 mai 2017

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ARN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ARN dilué est positif en PIF ou négatif en PIF avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.

4. Si l’ARN dilué est négatif en PIF avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce cas,

renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.

Interprétation dans le cas d’une analyse simultanée sur du sang et des selles provenant du même animal

Dans le cas d’un animal dont le sang a été trouvé négatif en PIF et dont les selles ont été trouvées positives en PIF, on peut conclure que

l’animal est viropositif en coronavirus, excréteur du virus dans les selles, mais qu’il ne présente aucun symptôme de la péritonite

infectieuse féline.

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur

thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux

dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance

technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également

appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux

produits chimiques d'autres fabricants, contacter

chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs

produits selon les termes et conditions générales de ventes

disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/

global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous

pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web

suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008841 (français)

Révision

Date

Description

B.0

31 mai 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

03 décembre2013

Base de référence pour l’historique de révision

Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de

diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.