Thermo Fisher Scientific PrioCHECK BRSV Ab serum cattle 7588991 Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: PrioCHECK BRSV Ab serum cattle 7588991

Taper: Mode d'emploi

PrioCHECK

BRSV Ab

Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du Virus Respiratoire Syncytial Bovin

dans le sérum de bovins

Coffret de 2 plaques pour 22 échantillons

Prionics AG

Version 1.0_f

Pour diagnostic in vitro uniquement

Usage strictement vétérinaire

Conserver à 5±3°C

Produit No.: 7588991

Introduction

Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est un virus

appartenant à la famille des Paramyxoviridae et au

genre Pneumovirus . Le VRS bovin ou VRSB est très

proche des autres VRS, humain, ovin et caprin. La

primo-infection à VRSB peut se manifester par une

atteinte grave du tractus respiratoire supérieur des

bovins mais elle peut aussi être asymptomatique.

Dans les zones d'endémie, la maladie touche surtout

les veaux et le tableau clinique est similaire à celui des

enfants infectés par le VRS humain. Après une primo-

infection naturelle à VRS, que ce soit chez les bovins

ou chez les humains, la protection est de courte durée

et les réinfections multiples sont courantes. La primo-

infection à VRSB est facile à diagnostiquer par un

titrage des anticorps spécifiques. On considère qu'il y

a séroconversion (= primo-infection) lorsque le titre

des anticorps est multiplié par 4 entre 2 prélèvements

successifs de sérum effectué chez l'animal.

Le test PrioCHECK

BRSV Ab est basé sur le test

décrit par Westenbrink et al. Le test ELISA, comparé

au test de neutralisation du virus, a une sensibilité

relative d'environ 90% et une spécificité relative de

100%.

Principe du test

Le test PrioCHECK

BRSV Ab est un ELISA indirect.

Un anticorps monoclonal spécifique du VRSB et une

protéine sans rapport avec le virus, sont coatés dans

les puits des barrettes. L'antigène VRSB est capturé

par l'anticorps monoclonal qui est coaté dans les puits.

Les sérums à tester dilués au 1/80 sont distribués

dans les puits. Pendant l'incubation, les anticorps anti–

BRSV présents dans l'échantillon se lient à l'antigène

capturé dans les puits. Puis les anticorps fixés sont

détectés grâce à un anticorps polyclonal anti-bovin

conjugué à la peroxydase de raifort (HRPO). Le

substrat chromogène (TMB) est ajouté, puis la colora-

tion est stoppée au bout de 15 minutes d'incubation et

la densité optique (DO) est mesurée à 450 nm.

Composition du coffret

Conserver le kit à 5±3°C jusqu'à la date d’expirati on

qui figure sur l'étiquette du coffret. La durée de

conservation des produits du coffret, une fois dilués,

ouverts ou reconstitués, est mentionnée au chapitre

s'y référant (voir ci-dessous).

Les informations sur les risques chimiques sont

données dans le paragraphe « Normes de Sécurité -

Risque et Sécurité » (Annexe II).

Composant 1

Microplaque

Deux plaques de barrettes sécables.

Composant 2

Conjugué (30x)

(concentré 30x, à diluer avant utilisation).

Un flacon contenant 1,5 ml de conjugué.

Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste

avant utilisation.

Composant 3

Tampon de dilution (5x)

(concentré 5x, à diluer avant utilisation).

Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution.

Stabilité du tampon de dilution solution de travail:

5 heures à 22±3°C.

Composant 4

Solution de lavage (200x)

(concentrée 200x, à diluer avant utilisation)

Un flacon contenant 60 ml de solution de lavage.

Stabilité de la solution de lavage: 1 semaine à 22±3°C.

Composant 5

Eau déminéralisée

Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée.

Composant 1

Sérum de cheval (lyophilisé)

Un flacon contenant 6,0 ml de sérum de cheval lyophi-

lisé.

Stabilité sérum de cheval reconstitué: jusqu’à la date

de péremption à -20°C.

Composant 7

Antigène (lyophilisé)

Deux flacons contenant 10 ml d'antigène lyophilisé.

Stabilité l’antigène reconstitué: en aliquots jusqu’à la

date de péremption à -20°C.

Composant 8

Sérum de contrôle 1 (lyophilisé)

Un flacon contenant 0,25 ml de sérum de contrôle 1.

Conservation du sérum de référence 1: jusqu’à la date

de péremption à -20°C.

Composant 9

Sérum de contrôle 2 (lyophilisé)

Un flacon contenant 0,25 ml de sérum de contrôle 2.

Conservation du sérum de référence 2: jusqu’à la date

de péremption à -20°C.

Composant 10

Sérum de contrôle 3 (lyophilisé)

Un flacon contenant 0,25 ml de sérum de contrôle 3.

Conservation du sérum de référence 3: jusqu’à la date

de péremption à -20°C.

Composant 11

Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène

(TMB).

Composant 12

Solution d'arrêt (prête à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt.

Autres composants du coffret:

- Notice d'utilisation

- 1 couvercle pour couvrir les barrettes pendant les

périodes d'incubation

- Certificat d'analyse

Equipement nécessaire mais non

fourni

Equipement général:

Equipement de laboratoire aux normes de sécurité

nationales.

Incubation:

Incubateur de microplaque (chauffant au moins à

50°C).

Analyse des résultats:

Lecteur de microplaques : Multiscan EX ou équivalent.

Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire

les plaques à 450 nm.

Equipement optionnel:

Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray

Washer ou équivalent.

Mode opératoire

Précautions

Les recommandations nationales pour la manipulation

d'échantillons animaux doivent être suivies de façon

stricte. Le test PrioCHECK

BRSV Ab ne doit être

réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela.

Les échantillons doivent être considérés comme

potentiellement infectieux. Tout matériel en contact

avec ces échantillons doit être considéré comme

potentiellement contaminé.

Les informations sur les risques chimiques sont

données dans le paragraphe « Normes de Sécurité -

Risque et Sécurité » (Annexe II).

Remarques

Pour obtenir des résultats optimums avec Prio-

CHECK

BRSV Ab, les précautions suivantes doivent

être prises:

 Le mode opératoire doit être rigoureusement

suivi.

 Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à

T° ambiante (22 ±3°C) avant utilisation.

 L'embout des pipettes doit être changé chaque fois

qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé.

 Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour

chaque réactif.

 Les composants du coffret ne doivent pas être

utilisés après la date de péremption ou si un chan-

gement dans leur aspect est observé.

 Les réactifs provenant de coffrets portant des

numéros de lots différents, ne doivent pas être as-

sociés dans une même série de tests.

 Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée

ou une eau équivalente.

SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE

Tampon de dilution solution de travail

Diluer le tampon de dilution concentré (5x) (Compo-

sant 3) dans 1/5 de l'eau déminéralisée.

Stabilité du tampon de dilution solution de travail: 5

heures à 22±3°C.

Sérum de cheval

Reconstituer

le sérum de cheval (Composant 6) dans

de l'eau déminéralisée (Composant 5). Conserver le

sérum de cheval reconstitué dans -20°C et bien

homogénéiser après décongélation.

Tampon ELISA

Ajouter le sérum de cheval reconstitué au tampon de

dilution pour obtenir une concentration finale de 4%.

Ajouter 400 µl de sérum de cheval à 9,6 ml de tampon

de dilution.

Le tampon ELISA peut être stocké à 22±3°C pendant

4 heures.

Antigène

Reconstituer

l'antigène (Composant 7) avec 10 ml le

tampon ELISA. Si le coffret n'est utilisé que partielle-

ment, l'antigène reconstitué doit être aliquoté en

volumes de 1,6 ml (pour un maximum de 6 séries de

tests par plaque). Eviter les congélations-

décongélations multiples et conserver l'antigène

aliquoté dans de petits tubes à -20°C.

Dilution du Conjugué

Préparer la dilution de travail du conjugué en diluant le

conjugué (30x) dans le tampon ELISA. Pour 2 barret-

tes: préparer 1.8 ml de conjugué dilué.

Remarque: La dilution de travail du conjugué doit

être préparée juste avant utilisation.

Sérums de contrôle

Reconstituer

le sérum (Composant 8, 9 et 10) avec

250 µl de l'eau déminéralisée (Composant 5). Après

reconstitution des sérums de contrôle, il est recom-

mandé de les aliquoter en tubles de 20 µl. Eviter les

Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :

- Ramener le flacon à 22±3°C.

- Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour

s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.

- Ouvrir le flacon.

- Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée.

- Allow the lyophilized material to dissolve.

- Reboucher le flacon et l'agiter doucement de manière à ce que le

lyophilisat soit entièrement dissout.

- Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.

- Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la

formation de mousse).

Notice d'utilisation

PrioCHECK

BRSV Ab

congélations-décongélations multiples et conserver les

aliquots à -20°C.

Solution de lavage

La solution de lavage (200x) (Composant 4) doit être

diluée 1/200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité

fournie permet de préparer un volume final de 12

litres. Stabilité de la solution de lavage diluée: 1

semaine à 22±3°C.

Remarque: Les lavages peuvent être effectués avec

un laveur automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas

de laveur automatique, le lavage des plaques peut

être fait manuellement avec 200 – 300 µl de solution

de lavage par puits. Vider ensuite les plaques et

répéter le lavage autant de fois que spécifié. Il n'est

pas nécessaire d'égoutter les plaques entre les cycles

de lavage. Tapoter fermement les barrettes sur du

papier absorbant après le dernier cycle de lavage.

PREPARATION DES DILUTIONS DES SERUMS

1.1 Préparer des dilutions au 1/80 des sérums de

contrôle 1,2 et 3 et des échantillons de sérums,

en mélangeant 10 µl de sérum avec 790 µl de

tampon ELISA.

INCUBATION DE L'ANTIGENE

2.1 Identifier chaque barrette(Composant 1) avec un

marqueur fin. (Il faut une plaque pour 11 titra-

ges).

2.2 Distribuer 100 µl de tampon ELISA dans les

puits de la rangée A, mais pas dans le puits A1.

Les puits de la rangée A sont les puits de

contrôle des sérums.

2.3 Distribuer 100 µl d'antigène dans tous les autres

puits.

2.4 Couvrir les barrettes avec le couvercle et incuber

60±5 minutes à 37±1°C.

INCUBATION DES SERUMS

3.1 Vider les barrettes et laver les puits 6 fois avec

200 à 300 µl de solution de lavage. Il est inutile

d'égoutter les plaques sur du papier absorbant

entre les lavages. Tapoter fermement la plaque

de barrettes sur du papier absorbant après le

dernier cycle de lavage.

3.2 Distribuer 100 µl de tampon ELISA dans les

puits A1 et B1 (= blanc).

3.3 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 1 dilué au

1/80 dans les puits C1 et D1.

3.4 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 2 dilué au

1/80 dans les puits E1 et F1.

3.5 Déposer 100 µl de sérum de contrôle 3 dilué au

1/80 dans les puits G1 et H1 de la plaque de

barrettes.

3.6 Distribuer 100 µl de tampon ELISA dans tous les

puits de C2 à H12.

3.7 Déposer 100 µl de sérum dilué au 1/80 dans les

puits A2 et B2. Puis effectuer des dilutions au

1/2.

dans le puits C2: 1/160 = 100 µl de sérum au

1/80 + 100 µl de tampon ELISA.

dans le puits D2: 1/320 = 100 µl de sérum au

1/160 + 100 µl de tampon ELISA.

dans le puits E2: 1/640 = 100 µl de sérum au

1/320 + 100 µl de tampon ELISA.

jusqu'au puits H2.

La dilution finale est 1/5120. Enlever 100 µl du

puits H2

3.7 Distribuer 100 µl de chacun des sérums dilués

au 1/80 dans les autres puits des rangées A, B

et C de la plaque de barrettes et effectuer les

mêmes dilutions que pour le premier sérum.

3.8 Couvrir les barrettes avec le couvercle et incuber

60±5 minutes à 37±1°C.

INCUBATION AVEC LE CONJUGUE

4.1 Vider les barrettes après l'incubation des sérums

et les laver 6 fois avec 200 – 300 µl la solution

de lavage. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les

plaques entre les cycles de lavage. Tapoter fer-

mement les barrettes sur du papier absorbant

après le dernier cycle de lavage.

4.2 Distribuer 100 µl de conjugué dans tous les

puits.

4.3 Couvrir la plaque et incuber 45±2 minutes à

37±1°C.

INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE

(TMB)

5.1 Vider les barrettes et les laver 6 fois avec 200 –

300 µl la solution de lavage. Il n'est pas néces-

saire d'égoutter les plaques entre les cycles de

lavage. Tapoter fermement les barrettes sur du

papier absorbant après le dernier cycle de la-

vage.

5.2 Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB)

(Composant 11) dans tous les puits.

5.3 Incuber les barrettes 15 minutes à 22±3°C.

5.4 Distribuer 100 µl de solution d'arrêt (Composant

12) dans tous les puits.

5.5 Homogénéiser le contenu des barrettes.

Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt

15 minutes après avoir déposé de substrat chromo-

gène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la solu-

tion d'arrêt dans tous les puits en gardant le même

ordre et le même rythme que pour distribuer le subs-

trat chromogène (TMB).

LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS

6.1 Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450

nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la

solution d'arrêt.

6.2 Calculer la DO

450

moyenne du blanc (puits A1 et

B1). Calculer la DO

450

corrigée de chaque sérum

(ou dilution de sérum) en soustrayant la DO

450

blanc. Calculer la DO

450

moyenne des sérums

de contrôle.

6.3 La DO

450

corrigée des échantillons de sérum est

exprimée en pourcentage de positivité (PP) par

rapport à la DO

450

corrigée du sérum de

contrôle 1 (sérum de contrôle positif) dilué au

1/80 (puits C1 et D1).

450

corrigée échantillon

PP = -------------------------------------------------- x 100

450

corrigée sérum de contrôle 1

INTERPRETATION DES RESULTATS

Validation des critères

7.1 La DO

450

moyenne des puits A1 et B1 (= DO

450

blanc) doit être < 0,300.

7.2 La DO

450

corrigée du sérum de contrôle 1 au

1/80 (puits C1 et D1) doit être ≥ 1.000.

7.3 Le PP du sérum de contrôle 3 doit être positif.

7.4 Le PP du sérum de contrôle 2 doit être négatif.

7.5 Les sérums positifs dans le puits de contrôle

(rangée A) doivent être interprétés comme suit:

la réactivité du sérum est non spécifique si le PP

du puits contrôle est > 30% et que le PP du

sérum dilué au 1/80 est < 2x le PP du puits

de contrôle correspondant.

7.6 Si les critères ci-dessus ne sont pas validés, les

résultats de la série de tests sont ininterpréta-

bles.

Remarque: Si la DO

450

moyenne corrigée du contrôle

de référence 1 est inférieure à 1,000, la solution de

substrat chromogène (TMB) était peut-être trop froide

au moment de son utilisation. Dans ce cas, penser à

ramener la solution de substrat à 22±3°C avant utilisa-

tion ou incuber les barrettes plus longtemps (sans

dépasser 30 minutes d'incubation).

Si la DO

450

moyenne corrigée du sérum de contrôle 1

est supérieure à 2,000, il est conseillé de réduire le

temps d'incubation avec le substrat chromogène

(TMB).

Interprétation du pourcentage de positivité

PP < 15% Négatif

Absence d'anticorps spécifiques du VRSB.

PP ≥ 15% Positif

Présence d'anticorps spécifiques du VRSB.

Annexe I

Avertissement

Les informations contenues dans cette notice sont considérées comme étant

complètes et exactes au moment de leur publication. Prionics AG ne peut en

aucun cas être tenu pour responsable des dommages fortuits ou indirects

liés à l'utilisation de ce document ou en résultant.

Responsabilité

Prionics AG garantit que ses produits sont conformes aux caractéristiques

décrites sous réserve qu'ils soient utilisés selon les instructions fournies et

dans les délais de conservation indiqués. Prionics AG exclut toute autre

garantie, explicite ou implicite, y compris la garantie d'aptitude à la vente ou

de conformité pour une utilisation particulière. La garantie mentionnée ici,

ainsi que les informations, spécifications et descriptions des produits

commercialisés par Prionics AG figurant dans les catalogues Prionics AG ou

dans tout autre document, ne peuvent pas être modifiées, sauf consente-

ment écrit express de Prionics AG. Les présentations orales ou écrites, ou

les publications non conformes à cette garantie ne sont pas autorisées et

sont sujettes à caution.

En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prionics AG se limite à la

réparation ou à l'échange, à sa discrétion, du produit ou d'une partie du

produit, sous réserve que le client informe rapidement Prionics AG de cette

rupture de garantie. Au cas où la société Prionics AG ne pourrait pas réparer

ou remplacer le produit ou une partie du produit, elle devra rembourser au

client l'intégralité des sommes perçues pour ce produit ou pour partie de ce

produit.

Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des dommages fortuits,

particuliers ou indirects y compris ceux résultant d'une perte économique ou

d'un dommage matériel subis par un client suite à l'utilisation de ses

produits.

Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entreprises certifiées ISO

9001:2000.

Annexe II

Normes de Sécurité - Risque et Sécurité

Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées de façon

stricte.

Risque et Sécurité

Composant 1

Microplaque