Thermo Fisher Scientific PrioCHECK CSFV Ag whole blood serum plasma tissue pig 7610050 Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: PrioCHECK CSFV Ag whole blood serum plasma tissue pig 7610050

Taper: Mode d'emploi

PrioCHECK

CSFV Ag

Test ELISA pour la détection in vitro de l'antigène de la Peste Porcine Classique dans le sang total, le sérum, le plasma et les échantil-

lons de tissus des porcs

Coffret de 5 plaques pour 450 échantillons

©Prionics AG

Version 1.0_f

Pour diagnostic in vitro uniquement

Usage strictement vétérinaire

Stocker à 5±3°C

Produit No.: 7610050

Introduction

La détection précoce des porcs infectés par le virus de

la peste porcine classique (VPPC) est essentielle pour

éviter la propagation du virus. Le dépistage précoce

des porcs infectés doit donc reposer sur la détection

antigénique du VPPC plutôt que sur la recherche des

anticorps anti-VPPC qui ne sont détectables que 14

jours environ après le début de l'infection.

PrioCHECK® CSFV Ag est un outil précieux qui

permet de poser le diagnostic d'infection à VPPC avec

plus de certitude et qui a été conçu pour donner le

minimum de résultats faussement positifs (spécificité

et sélectivité élevées) tout en préservant la plus

grande sensibilité possible. PrioCHECK® CSFV Ag

peut être utilisé pour contrôler les élevages de porcs

suspectés d'être infectés par le VPPC. Dans les pays

(ou régions) d'endémie de la peste porcine où la

vaccination est souvent pratiquée, le test peut être

utilisé pour rechercher les foyers résiduels de VPPC.

Les résultats positifs doivent être confirmés par un test

de référence (isolement du virus par culture cellulaire).

Principe du test

PrioCHECK® CSFV Ag est un test ELISA de type

sandwich. Un anticorps spécifique du VPPC est fixé

sur les barrettes. Dans un premier temps, le diluant

échantillons et les échantillons (sang total, sérum,

plasma, concentré leucocytaire ou extrait tissulaire)

sont distribués dans les puits et incubés. Les barrettes

sont ensuite lavées et un conjugué anti-VPPC très

spécifique est ajouté dans tous les puits. Après incu-

bation et lavage des barrettes, le conjugué fixé est

révélé par addition d'un substrat chromogène (TMB).

A la fin de la période d'incubation du substrat, le

développement de la coloration est stoppé et la densi-

té optique (DO) est mesurée à 450 nm afin de mettre

en évidence la présence d'antigène spécifique de la

peste porcine classique.

Composition du coffret

Conserver le kit à 5±3°C jusqu’à la date d’expirati on

qui figure sur l’étiquette du coffret. La durée de

conservation des produits du coffret, une fois qu'ils

sont dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée

au chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Les informa-

tions concernant les risques chimiques sont fournies

au paragraphe « Consignes de Sécurité et Phrases de

Risque et de Sécurité » (Annexe II).

Composant 1

Plaque de microtitration

Cinq plaques de barrettes sécables.

Composant 2

Conjugué (30x)

(concentré 30x, à diluer avant utilisation). Un flacon

contenant 2,2 ml de conjugué.

Le conjugué dilué n’est pas stable, préparer juste

avant utilisation.

Composant 3

Tampon de dilution (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution.

Composant 4

Additif du conjugué (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 12,0 ml d'additif du conjugué.

Composant 5

Eau déminéralisée

Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée.

Composant 6

Solution de lavage (200x)

(concentré 200x, à diluer avant utilisation). Un flacon

contenant 60 ml de solution de lavage.

Conservation de la solution de lavage : 1semaine à

22±3°C.

Composant 7

Diluant échantillons (prêt à l'emploi)

Trois flacons contenant 10 ml de diluant échantillons.

Composant 8

Sérum de contrôle 1 (lyophilisé)

Un flacon contenant 1,5 ml de sérum de contrôle 1

(contrôle positif fort).

Conservation du sérum de référence 1 reconstitué : à -

20°C jusqu’à la date d’expiration.

Composant 9

Sérum de contrôle 2 (lyophilisé)

Un flacon contenant 1,5 ml de sérum de contrôle 2

(blanc).

Conservation du sérum de référence 2 reconstitué : à -

20°C jusqu’à la date d’expiration.

Composant 10

Sérum de contrôle 3 (lyophilisé)

Un flacon contenant 1,5 ml de sérum de contrôle 3

(contrôle positif faible).

Conservation du sérum de référence 3 reconstitué : à -

20°C jusqu’à la date d’expiration.

Composant 11

Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène

(TMB).

Composant 12

Solution d'arrêt (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt.

Autres composants du coffret:

- 10 films adhésifs pour couvrir les plaques

- Notice d'utilisation

- Certificat d'analyse

Equipement nécessaire mais non

fourni

Equipement général:

Equipement de laboratoire aux normes de sécurité

nationales.

Analyse des résultats:

Lecteur de microplaques: Multiscan EX ou équivalent.

Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire

les plaques à 450 nm.

Equipement optionnel:

Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray

Washer ou équivalent.

Mode opératoire

Précautions

Les recommandations nationales pour la manipulation

d'échantillons animaux doivent être suivies de façon

stricte. Le test PrioCHECK® CSFV Ag ne doit être

réalisé que dans les laboratoires équipés pour cela.

Les échantillons doivent être considérés comme

potentiellement infectieux. Tout matériel en contact

avec ces échantillons doit être considéré comme

potentiellement contaminé. La décontamination peut

être faite avec de l'halamid à 1%, de l'hydroxyde de

sodium à 0.4% ou du glutaraldéhyde à 1% (baisse de

la concentration de VPPC de 4 à 5 log en 6 minutes).

Les échantillons à analyser doivent être conservés

stérilement afin de pouvoir confirmer ultérieurement

les résultats par isolement du virus.

Les informations concernant les risques chimiques

sont fournies dans le paragraphe « Consignes de

Sécurité et Phrases de Risque et de Sécurité » (An-

nexe II).

Remarques

Pour obtenir des résultats optimums avec Prio-

CHECK® CSFV Ag, les précautions suivantes doivent

être prises:

 Le mode opératoire doit être rigoureusement

suivi.

 Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés à

T° ambiante (22±3°C) avant utilisation.

 L'embout des pipettes doit être changé à chaque

fois qu'un nouvel échantillon ou réactif est prélevé.

 Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour

chaque réactif.

 Les composants du coffret ne doivent pas être

utilisés après la date de péremption ou si un chan-

gement dans leur aspect est observé.

 Les réactifs provenant de coffrets portant des

numéros de lots différents, ne doivent pas être as-

sociés dans une même série de tests.

 Le test doit être réalisé avec de l'eau déminéralisée

ou une eau équivalente.

SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE

Contrôles

Reconstituer1 les contrôles (Composant 8-10) avec 1.5

ml de l'eau déminéralisée (Composant 5). Les sérums

de contrôle lyophilisés, une fois reconstitués, doivent

être aliquotés en petits tubes et conservés à -20°C

jusqu’à la date d’expiration. Le nombre d'aliquots

dépend du nombre de séries de tests prévu (max. 12

séries de tests).

Dilution du conjugué

Préparer la dilution de travail du conjugué en diluant le

conjugué (30x) (Composant 2) dans le tampon de

dilution (Composant 3) auquel aura été ajouté au

préalable 20% (v/v) d'additif du conjugué. Pour une

plaque de microtitration: ajouter 2,4 ml d'additif du

conjugué à 9,2 ml de tampon de dilution. Puis ajouter

400 µl de conjugué concentré (30x).

Solution de lavage

La solution de lavage (200x) (Composant 6) doit ètre

dilué 1/200 dans de l'eau déminéralisée. La quantité

fournie est suffisante pour préparer un volume final de

12 litres.

Stabilité de la solution de lavage diluée: 1 semaine à

22±3°C.

Remarque: Le lavage des puits après incubation est une étape

essentielle. Si la DO du blanc (sérum de contrôle 2) est >0,300,

cela peut signifier que le lavage des puits est insuffisant. En cas

de lavage manuel, laver les barrettes au moins 6 fois : distri-

buer 300 µl de solution de lavage dans chaque puits, vider les

barrettes puis les tapoter soigneusement sur du papier absor-

bant avant de les remplir à nouveau. Eviter la formation de

bulles d'air lors du remplissage des puits. Après le dernier

lavage, veiller à ce qu'il ne reste plus de liquide de lavage au

fond des puits en tapotant les barrettes sur du papier absor-

bant. Si, lorsque le lavage est effectué avec un laveur automa-

tique, la DO du blanc est >0,300, opter pour le lavage manuel

(voir ci-dessus).

Remarque: Voir Annexe IV pour la préparation et la

conservation des échantillons

INCUBATION DES SERUMS

1.1 Identifier chaque barrette (Composant 1) avec

Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière suivante :

- Ramener le flacon à 22±3°C

- Tenir le flacon verticalement et le tapoter doucement contre le plan de

travail pour s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond

du flacon.

- Ouvrir le flacon.

- Ajouter la quantité d'eau déminéralisée spécifiée (voir l'étiquette du

flacon).

- Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat se dissoudre.

- Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.

- Laisser reposer le réactif reconstitué 15 minutes à 22±3°C.

- Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la

formation de mousse).

Notice d'utilisation

PrioCHECK

CSFV Ag

un marqueur fin.

1.2 Distribuer 50 µl de diluant échantillons (Compo

sant 7) dans tous les puits.

1.3 Déposer 50 µl de contrôle 1 dans les puits A1 et

B1.

1.4 Déposer 50 µl de contrôle 2 dans les puits C1 et

D1.

1.5 Déposer 50 µl de contrôle 3 dans les puits E1 et

F1.

1.6 Déposer 50 µl d'échantillon dans les autres

puits.

1.7 Couvrir les plaques avec un film adhésif et agiter

doucement les barrettes.

1.8 Incuber 180±5 minutes à 22±3°C.

Remarque: Si l'échantillon est du sang total, vérifier

qu'il ne reste plus de sang dans l'embout de la pipette

après avoir déposé l'échantillon dans le puits.

INCUBATION AVEC LE CONJUGUE

2.1 Vider les barrettes et laver 6x avec 300 µl de

solution de lavage dilué par puits. Tapoter fer-

mement les plaques après le dernier cycle de la-

vage.

Remarque: Il ne doit pas rester de sang dans les puits.

2.2 Distribuer 100 µl de conjugué dilué dans tous les

puits.

2.3 Couvrir les plaques avec un film adhésif.

2.4 Incuber 60±5 minutes à 22±3°C.

INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE

(TMB)

3.1 Vider les barrettes et laver 6x avec 300 µl de

liquide de lavage dilué par puits. Tapoter fer-

mement les plaques sur du papier absorbant

après le dernier cycle de lavage.

3.2 Distribuer 100 µl de substrat chromogène

(TMB) (Composant 11) dans tous les puits.

3.3 Incuber 15 minutes à 22±3°C. Ne pas agiter.

3.4 Ajouter 100 µl de solution d'arrêt (Composant

12).

3.5 Homogénéiser le contenu des barrettes.

Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt

15 minutes après avoir déposé la solution de substrat

chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la

solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même

ordre et le même rythme que pour distribuer le subs-

trat chromogène (TMB).

LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS

4.1 Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450

nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la

solution d'arrêt.

4.2 Calculer la DO450 moyenne des puits C1 et D1

(contrôle 2 = DO450 blanc).

4.3 Calculer la DO450 corrigée de tous les échantil-

lons en soustrayant la DO450 blanc.

4.4 Le pourcentage de positivité (PP) du contrôle 3

et des échantillons est calculé selon la formule

ci-dessous.

La DO450 corrigée des échantillons est exprimée en

pourcentage de positivité (PP) par rapport à la DO450

du contrôle 1.

450

corrigée de l'échantillon

PP = ------------------------------------------------ x 100

450

corrigée du contrôle 1

INTERPRETATION DES RESULTATS

Validation des critères

5.1 La DO450 du contrôle 2 doit être <0.350.

5.2 La DO450 corrigée du contrôle 1 doit être au

moins égale à 0,750.

5.3 Le PP du contrôle 3 doit être >20%.

Remarque: Si ces critères ne sont pas validés, les

résultats de la série de test sont ininterprétables.

Remarque: Si la DO450 moyenne corrigée du contrôle

1 est inférieure à 0,750, la solution de substrat chro-

mogène (TMB) était peut-être trop froide au moment

de son utilisation. Dans ce cas, penser à ramener la

solution de substrat à 22±3°C avant utilisation ou

incuber les barrettes plus longtemps (sans dépasser

30 minutes d'incubation). Si la DO450 moyenne corri-

gée du contrôle 1 est supérieure à 2,000, il est conseil-

lé de réduire le temps d'incubation avec le substrat

chromogène (TMB).

Interprétation du pourcentage de positivité

PP = < 15% Négatif

Absence d'antigène du VPPC détectable dans l'échan-

tillon testé.

PP = ≥15% Positif

Présence d'antigène du VPPC dans l'échantillon testé.

La présence d'antigène du VPPC dans les échantil-

lons positifs doit être confirmée par l'isolement du

virus.

Annexe I

Avertissement

Les informations contenues dans cette notice sont considérées

comme étant complètes et exactes au moment de leur publica-

tion. Prionics AG ne peut en aucun cas être tenu pour respon-

sable des dommages fortuits ou indirects liés à l'utilisation de

ce document ou en résultant.

Responsabilité

Prionics AG garantit que ses produits sont conformes aux

caractéristiques décrites sous réserve qu'ils soient utilisés selon

les instructions fournies et dans les délais de conservation

indiqués. Prionics AG exclut toute autre garantie, explicite ou

implicite, y compris la garantie d'aptitude à la vente ou de

conformité pour une utilisation particulière. La garantie men-

tionnée ici, ainsi que les informations, spécifications et descrip-

tions des produits commercialisés par Prionics AG et figurant

dans les catalogues Prionics AG ou dans tout autre document,

ne peuvent pas être modifiées, sauf consentement écrit

express de Prionics AG. Les présentations orales ou écrites, ou

les publications non conformes à cette garantie ne sont pas

autorisées et sont sujettes à caution.

En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prionics AG se

limite à la réparation ou à l'échange, à sa discrétion, du produit

ou d'une partie du produit, sous réserve que le client informe

rapidement Prionics AG de cette rupture de garantie. Au cas où

la société Prionics AG ne pourrait pas réparer ou remplacer le

produit ou une partie du produit, elle devra rembourser au client

l'intégralité des sommes perçues pour ce produit ou pour partie

de ce produit.

Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des dommages

fortuits, particuliers ou indirects y compris ceux résultant d'une

perte économique ou d'un dommage matériel subis par un

client suite à l'utilisation de ses produits.

Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entreprises

certifiées ISO 9001:2000.

Annexe II

Normes de Sécurité et Phrases de Risque et de Sécurité

Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appliquées

de façon stricte.

Composant 1

Plaque de microtitration