Thermo Fisher Scientific VetMAX Ruminant Abortion Screening Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Ruminant Abortion Screening Kit

Taper: Mode d'emploi

VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Protocoles de puriﬁcation d’acides nucléiques optimisés pour une utilisation avec le kit (Réf. SARP)

Pub. nº MAN0008873 Rév. C.0

Espèces Matrices d’échantillons Type de test

Ruminants

• Écouvillons placentaires, vaginaux et

cervicaux

• Organes (fœtus, placenta)

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les ﬁches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de protection, des gants et des vêtements appropriés. Les ﬁches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermoﬁsher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUE BIOLOGIQUE. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques du produit

disponibles sur thermoﬁsher.com. Suivre toutes les réglementations du travail avec des échantillons biologiques locales,

nationales et/ou communautaires en vigueur.

■Objectif de ce guide ....................................................................................... 1

■Choix de l’échantillon ...................................................................................... 2

■Conservation des échantillons ............................................................................... 2

■Matériels requis non fournis ................................................................................. 2

■Méthode ................................................................................................. 4

■Instructions .............................................................................................. 4

■Préparation des échantillons pour la puriﬁcation ................................................................. 5

■Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode automatique) .................. 5

■Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique) ............................ 10

■Puriﬁcation de l’ADN avec QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle) ............................................... 11

■Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle) ............................................. 12

■Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR ........................................................ 14

Annexe A Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL

■Matériels requis non fournis ................................................................................ 15

■Procédure de puriﬁcation .................................................................................. 15

Annexe B Documentation et support

■Assistance à la clientèle et support technique .................................................................. 16

■Garantie limitée du produit ................................................................................. 16

Objectif de ce guide

Ce guide décrit les protocoles de puriﬁcation d’ADN pour les huit pathogènes principaux responsables des avortements chez les

ruminants (Coxiella burnetii, Chlamydophila spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira pathogens,

Anaplasma phagocytophila et Bovine herpesvirus 4). Les méthodes ont été validées et optimisées pour une utilisation en aval avec

Applied Biosystems™ VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit (Réf. SARP).

• La puriﬁcation automatisée des acides nucléiques est réalisée à l’aide de l’un des instruments suivants : KingFisher™ Flex, MagMAX™

Express-96, KingFisher™ mL ou KingFisher™ Duo Prime.

GUIDE COMPLÉMENTAIRE

Pour usage en laboratoire.

• La puriﬁcation manuelle des acides nucléiques utilise des colonnes de centrifugation à base de silice.

Choix de l’échantillon

Type d’échantillon Type d’analyse Quantité requise et équipement de prélèvement

Écouvillons placentaires, vaginaux et

cervicaux Individuel Écouvillon sec stérile

Organe (fœtus, placenta) Individuel 20 à 30 mg de tissu

Conservation des échantillons

Type d’échantillon Conservation

Écouvillons

placentaires, vaginaux

et cervicaux

Après le prélèvement, conserver les échantillons entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation (sous 48 heures maximum).

Après l’élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluat pour réaliser la PCR. Après utilisation ou à expiration du délai de

48 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation dans l’année ou en dessous de -70°C pour

une conservation à long terme.

Organe (fœtus,

placenta) Après le prélèvement, conserver selon le cas de ﬁgure :

• conserver les échantillons entre 2°C et 8°C si l’analyse est eectuée dans les 24 heures suivant le prélèvement ;

• conserver les échantillons en dessous de -16°C si l’analyse est eectuée au-delà des 24 heures suivant le prélèvement.

Après utilisation ou à expiration du délai de 24 heures, conserver les échantillons en dessous de -16°C pour une utilisation

dans l’année ou en dessous de -70°C pour une conservation à long terme.

Matériels requis non fournis

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermoﬁsher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur

ﬁsherscientiﬁc.com ou auprès d'un autre grand fournisseur de laboratoire.

Matériel nécessaire pour la collecte d’échantillon, la préparation, et la puriﬁcation des acides nucléiques

Tableau 1 Matériel requis pour toutes les méthodes de préparation des échantillons

Article Source

Équipement

Poste de Sécurité Microbiologique de type II (PSMII) PFL

Centrifugeuse de paillasse PFL

Agitateur de laboratoire, vortex ou équivalent PFL

Micropipettes de précision ajustables (de 1 µl à 1 000 µl) PFL

Consommables

Embouts de pipette résistant aux aérosols, sans nucléase PFL

Microtubes DNase/RNase-free de 1,5 ml et 2,0 ml PFL

Réactifs

Eau sans nucléase AM12450

PBS (1X), pH 7.4 PFL

2Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Tableau 2 Matériels supplémentaires nécessaires pour la puriﬁcation des échantillons d’organes

Article Source

Équipement

(Facultatif) Broyeur de tissus pour l’agitation avec billes, parmi les modèles suivants ou équivalent :

• Fisher Scientiﬁc™ Bead Mill 24 Homogenizer

• Precellys™ 24 Homogenizer (Bertin)

• Instrument FastPrep‑24™ (MP Biomedical 116004500)

• Mixer Mill 400 (Verder 207450001)

• Fisher Scientiﬁc 15-340-163

• Bertin EQ03119.200.RD000.0

• Fisher Scientiﬁc MP116004500

• Fisher Scientiﬁc 08 418 241

Balance de précision PFL

PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm), ou billes en verre de 3 mm équivalentes Fisher Scientiﬁc™ 11-312-10A

Scalpels et pinces métalliques (stériles) PFL

Consommables

Boîte de Petri (stérile) PFL

Matériels supplémentaires nécessaires pour la puriﬁcation automatisée des acides nucléiques

Tableau 3 Matériel nécessaire pour la procédure MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit

Article Source

Instrument, l’un des suivants :

KingFisher™ Flex Puriﬁcation System

Contacter le représentant commercial

local.

MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor

KingFisher™ Duo Prime Puriﬁcation System

KingFisher™ mL Puriﬁcation System

Équipement

Bloc chauant à 55°C PFL

Réservoir de réactifs PFL

Consommables

Adhesive PCR Plate Foils, ou équivalent AB0626

Consommables pour les instruments KingFisher™ Flex et MagMAX™ Express-96 :

• KingFisher™ Deepwell 96 plaque

• KingFisher™ 96 KF microplates

• KingFisher™ 96 tip comb for DW magnets

• 95040450

• 97002540

• 97002534

Consommables pour les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL Voir Tableau 8 en page 15.

Kits et réactifs

MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit A32700 ou A32702

PBS, pH 7.4 (10 fois), exempt de RNase AM9624

Tableau 4 Matériel nécessaire pour la procédure MagVet™ Universal Isolation Kit

Article Source

Instrument, l’un des suivants :

KingFisher™ Flex Puriﬁcation System

Contacter le représentant commercial

local.

MagMAX™ Express‑96 Magnetic Particle Processor

KingFisher™ mL Puriﬁcation System

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 3

Article Source

Équipement

Bloc chauant à 70°C PFL

Réservoir de réactifs PFL

Kits et réactifs

MagVet™ Universal Isolation Kit MV384

MBL2 Buer 12143

Protéinase K (PK) • Qiagen 19131

• Macherey Nagel 740396

Éthanol à 80 % PFL

Matériels supplémentaires nécessaires pour la puriﬁcation manuelle des acides nucléiques

Article Source

Équipement

Bloc chauant à 70°C PFL

Kits et réactifs

L’un des kits suivants :

• QIAamp™ DNA Mini Kit

• Kit NucleoSpin™ Tissue

• Qiagen 51304

• Macherey Nagel 740952

Éthanol à 96-100 % PFL

Méthode

Méthode de puriﬁcation d’acides nucléiques automatisée et manuelle

Préparation des échantillons pour la puriﬁcation

Préparer les échantillons conformément à votre méthode de puriﬁcation, puis eectuer le protocole de puriﬁcation convenant à votre

laboratoire.

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode automatique)

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique)

Puriﬁcation de l’ADN avec QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle)

Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle)

Instructions

Préparer au moins un échantillon témoin puriﬁé à utiliser en tant que contrôle négatif d’extraction. Utiliser PBS (1X), pH 7.4 ou de

l’eau sans nucléase au lieu de l’échantillon testé, sauf indication contraire. Traiter l’échantillon témoin puriﬁé en même temps que les

échantillons testés, en utilisant le même protocole de puriﬁcation d’acides nucléiques.

4Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Préparation des échantillons pour la puriﬁcation

1. Préparer les échantillons comme décrit.

Type d’échantillon Méthode de puriﬁcation Action

Écouvillon placentaire,

vaginal et cervical Automatisée ou manuelle 1. Casser la pointe de l’écouvillon et l’ajouter à un tube de 2 ml.

2. Ajouter 1 ml de PBS (1X), pH 7.4 à chaque échantillon.

3. Vortexer pendant 3 minutes.

4. Presser l’écouvillon contre la paroi du tube pour en faire sortir le liquide, puis jeter

l’écouvillon.

5. Procéder avec 200 µl d’éluat.

Organe (fœtus, placenta)[1] Automatisée

(avec broyage) Méthode de broyage : Préparer les échantillons d’organes à l’aide d’un broyeur de tissus.

1. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml :

• Tissu : 20 à 30 mg

• PBS (1X), pH 7.4 : 1 ml

• PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes

2. Broyer (agiter avec les billes) les échantillons.

• Fisher Scientiﬁc™ Bead Mill 24 Homogenizer : 6 m/s pendant 45 secondes

• Mixer Mill 400 : 30 Hz pendant 2 minutes

3. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes.

4. Procéder avec 200 µl de surnageant.

Méthodes d’échantillon non broyé avec des billes : Préparer les échantillons d’organes à

l’aide d’un agitateur vortex.

1. Hacher ﬁnement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide de pinces

et d’un scalpel stériles.

2. Ajouter les composants suivants dans un tube de 2 ml :

• Tissu (haché ﬁnement) : 20 à 30 mg

• PBS (1X), pH 7.4 : 1 ml

• PYREX™ Solid Glass Beads for Distillation Columns (3 mm) : 2 billes

3. Vortexer vigoureusement.

4. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes.

5. Procéder avec 200 µl de surnageant.

Manuelle

(sans broyage)

1. Hacher ﬁnement le morceau d’organe dans une boîte de Petri stérile à l’aide de pinces

et d’un scalpel stériles.

2. Procéder avec 20 à 30 mg de tissu haché.

[1] Sélectionner la méthode de préparation convenant à votre laboratoire.

2. Eectuer la puriﬁcation d’ADN avec le volume approprié de l’échantillon préparé.

•“Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode automatique)” en page 5

•“Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique)” en page 10

•“Puriﬁcation de l’ADN avec QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle)” en page 11

•“Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle)” en page 12

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (méthode

automatique)

Suivre cette procédure si les instruments suivants sont utilisés :

• KingFisher™ Flex

• MagMAX™ Express-96

Suivre l’Annexe A, “Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL” si les instruments suivants sont utilisés :

• KingFisher™ Duo Prime

• KingFisher™ mL

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 5

Méthode

Méthode avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit

Préparation des plaques pour le traitement

Préparation de la Lysis/PK Solution

Traitement des échantillons avec la Lysis/PK Solution

Mélanger les échantillons avec le mélange de Binding/Bead

Placement des échantillons dans l’instrument

Instructions

• Avant utilisation, retourner les bouteilles de solutions et de tampons pour bien les mélanger.

• Pour éviter toute contamination croisée :

– Couvrir la plaque ou la barrette de tubes pendant les étapes d’incubation et d’agitation, pour éviter tout débordement.

– Pipetter avec précaution les réactifs et les échantillons pour éviter les éclaboussures.

• Pour éviter toute contamination par les nucléases :

– Porter des gants de laboratoire pendant les procédures. Les gants vous protègent des réactifs, et ils protègent l’acide nucléique

des nucléases présentes sur la peau.

– Utiliser des embouts de pipettes exempts d’acide nucléique pour manipuler les réactifs, et éviter de mettre des embouts utilisés

dans les récipients de réactifs.

– Décontaminer les paillasses de laboratoire et les pipettes avant de commencer.

Avant la première utilisation du kit

(Optionnel) Déterminer les paramètres optimaux du broyeur à billes

Nous recommandons l’utilisation de Fisher Scientiﬁc™ Bead Mill 24 Homogenizer pour un rendement maximal en acides nucléiques. Si un

autre instrument est utilisé, suivre les directives du fournisseur pour déterminer les paramètres de vitesse et de temps pour obtenir une

lyse de cellules susante.

Téléchargement et installation du script

Le script adéquat pour MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit doit être installé sur l’instrument avant sa première utilisation.

1. Sur la page internet du produit MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit (à l’adresse thermoﬁsher.com, eectuer une

recherche à partir de la référence), faire déﬁler jusqu’à la section Documentation du produit.

2. Faire un clic droit sur le ﬁchier approprié pour télécharger la version la plus récente du script MagMAX_CORE pour votre instrument.

Tableau 5 Scripts recommandés

Instrument Nom du script

KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex.bdz

KingFisher™ 96

MagMAX™ Express-96

MagMAX_CORE_KF-96.bdz

KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO.bdz

KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz

Si requis par votre laboratoire, utiliser l’un des scripts suivants, qui ne chaue pas le liquide lors de l’étape d’élution.

6Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Tableau 6 Scripts alternatifs sans étape d’élution chauée

Instrument Nom du script

KingFisher™ Flex MagMAX_CORE_Flex_no_heat.bdz

KingFisher™ 96

MagMAX™ Express-96

MagMAX_CORE_KF-96_no_heat.bdz

KingFisher™ Duo Prime MagMAX_CORE_DUO_no_heat.bdz

KingFisher™ mL MagMAX_CORE_mL_no_heat.bdz

3. Se référer au guide de l’utilisateur de l’instrument ou contacter l’assistance technique pour connaître les instructions d’installation du

script.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

a. Préparation des plaques pour le traitement.

Tableau 7 Conﬁguration de la plaque : Instrument KingFisher™ Flex ou MagMAX™ Express-96

ID de la

plaque Position de la

plaque[1] Type de

plaque Réactif Volume par

puits

Plaque de

lavage 1 2 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Plaque de

lavage 2 3 Deep Well MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution 4 Standard MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne 5 Standard Placer un peigne protecteur dans la plaque.

[1] Position sur l’instrument.

Remarque : Pour conﬁgurer les plaques ou les barrettes de tubes pour l’instrument KingFisher™

Duo Prime ou KingFisher™ mL, voir Annexe A, “Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo

Prime ou KingFisher™ mL”.

b. (Facultatif) Pour éviter l’évaporation et la contamination, couvrir les plaques préparées avec une

feuille adhésive jusqu’à ce qu’elles soient chargées dans l’instrument.

1Préparation des plaques

pour le traitement

Préparer la Lysis/PK Solution au moment de l’utilisation. Ne pas mélanger à l’avance.

a. Mélanger les composants suivants, dans l’ordre indiqué, pour le nombre requis d’échantillons

plus 10 % d’excédent.

1. Mélanger MagMAX™ CORE Lysis Solution avec le PBS (1X), pH 7.4.

Composant Volume par échantillon

MagMAX™ CORE Lysis Solution 200 μl

PBS (1X), pH 7.4 200 μl

Total de Lysis Solution diluée 400 μl

2. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour

recueillir le contenu au fond du tube.

2 Préparation de la

Lysis/PK Solution

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 7

2Préparation de la

Lysis/PK Solution

(suite)

3. Ajouter MagMAX™ CORE Proteinase K à la Lysis Solution diluée.

Remarque : Le PK Buer n’est pas requis pour ce protocole.

Composant Volume par échantillon

Lysis Solution diluée 400 μl

MagMAX™ CORE Proteinase K 10 μl

Volume total de la Lysis/PK Solution 410 μl

b. Retourner plusieurs fois le tube pour homogénéiser, puis centrifuger brièvement pour recueillir le

contenu au fond du tube.

Suivre cette procédure dans des tubes individuels pour éviter la contamination. Ne pas utiliser de

plaques.

a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué.

Composant Volume par échantillon Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé 200 μl —

PBS (1X), pH 7.4 — 200 μl

Lysis/PK Solution 410 μl 410 μl

b. Vortexer brièvement pour mélanger l’échantillon avec la Lysis/PK Solution.

c. Incuber l’échantillon selon le type d’échantillon.

Pour... Faire...

Éluat d’écouvillon placentaire, vaginal et cervical Incuber 30 minutes à 55°C.

Surnageant d’organe Incuber entre 30 minutes et 2 heures à 55°C.

d. Centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube.

3Traitement des

échantillons avec la

Lysis/PK Solution

a. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon (jusqu’à 610 μL) dans les puits

appropriés de la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes.

b. Vortexer vigoureusement MagMAX™ CORE Magnetic Beads pour s’assurer que les billes sont

complètement resuspendues.

c. Préparation du mélange de Binding/Bead - Mélanger les composants suivants pour le nombre

requis d’échantillons plus 10 % d’excédent.

Composant Volume par échantillon

MagMAX™ CORE Binding Solution 400 µl

MagMAX™ CORE Magnetic Beads 20 μl

Mélange de Binding/Bead total 420 µl

d. Remuer le mélange de Binding/Bead par inversion jusqu’à ce que la solution soit homogène,

puis ajouter 420 μL du mélange de Binding/Bead dans chaque échantillon.

e. Procéder immédiatement au placement des échantillons dans l’instrument (section suivante).

4Mélanger les échantillons

avec le mélange de

Binding/Bead

8Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

a. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script”

en page 6).

b. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque

l’instrument vous invite à le faire.

Conserver l’acide nucléique puriﬁé sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois

maximum, ou à -80°C pour une conservation à long terme.

5Placement des

échantillons dans

l’instrument

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 9

Puriﬁcation de l’acide nucléique avec MagVet™ Universal Isolation Kit (méthode automatique)

Le protocole suivant peut être utilisé avec les instruments KingFisher™ Flex, KingFisher™ mL et MagMAX™ Express-96.

Avant la première utilisation du kit

Remarque : Les produits PK et MBL2 Buer doivent être commandés séparément du kit.

• Préparation du tampon de lyse NM1 Buer : ajouter 100 ml de tampon N1 Buer dans la bouteille contenant le tampon M1 Buer

(25 ml), puis vortexer pour bien mélanger.

Conserver le tampon de lyse NM1 Buer à température ambiante jusqu’à 1 an.

• Reconstitution de la PK : suivre les recommandations du fournisseur.

Avant chaque utilisation du kit

Préparer le mélange MBL2+Beads : mélanger les composants suivants pour le nombre d’échantillons requis, plus 5 à 10 % d’excédent,

puis vortexer aﬁn de bien mélanger.

Composant Volume par échantillon

MBL2 Buer 500 µl

NM_LSI_Beads 20 µl

Éliminer le mélange MBL2+Beads après utilisation.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis homogénéiser l’échantillon.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé 200 µl —

PBS (1X), pH 7.4 — 200 µl

Protéinase K • Qiagen : 20 µl

•Macherey Nagel : 25 µl

• Qiagen : 20 µl

• Macherey Nagel : 25 µl

Tampon de lyse NM1 280 µl 280 µl

b. Incuber à 70°C pendant 30 minutes.

1 Traitement du lysat avec

la PK

Préparer les plaques ou barrettes de tubes pour le traitement à l’extérieur de l’instrument comme

décrit dans le tableau suivant.

Position[1] Type de plaque[2] Réactif Volume par puits

2 Deep Well NM3 Wash Buer 600 µl

3 Deep Well NM4 Wash Buer 600 µl

4 Deep Well Éthanol à 80 % 600 µl

5 Standard Tampon d’élution NM6 200 µl

6 Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque ou la

barrette de tubes.

[1] Position sur l’instrument.

[2] Non applicable en cas d’utilisation de barrettes de tubes.

2Préparation des plaques

ou barrettes de tubes

pour le traitement

10 Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

a. Une fois l’incubation à 70°C terminée, centrifuger les échantillons brièvement pour faire diminuer

la condensation.

b. Transférer tout le volume de chaque lysat d’échantillon jusqu’à dans les puits appropriés de la

plaque d’échantillons ou la barrette de tubes.

c. Vortexer vigoureusement le mélange MBL2+Beads pour s’assurer que les billes sont

complètement resuspendues.

d. Ajouter 520 µl de mélange MBL2+Beads pour chaque échantillon et contrôle.

e. Sélectionner le script approprié sur l’instrument.

• KingFisher™ Flex/MagMAX™ Express-96 : NM_LSI_RRC96

• KingFisher™ mL : NM_LSI_15prep

f. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées dans la position appropriée lorsque

l’instrument vous invite à le faire.

Charger la plaque d’échantillons ou la barrette de tubes à la position 1 sur l’instrument.

Remarque : Si vous utilisez l’instrument KingFisher™ mL, charger le peigne et toutes les

barrettes de tubes en même temps. L’instrument ne vous invite pas à charger les éléments

individuellement.

g. À la ﬁn du test, lorsque l’instrument le demande, retirer la plaque ou les tubes contenant l’acide

nucléique puriﬁé.

Instrument Procédure

• KingFisher™ Flex

• MagMAX™ Express-96

Enlever la plaque en position 5 puis couvrir d’un ﬁlm adhésif.

KingFisher™ mL Enlever la barrette de tubes et transférer l’acide nucléique puriﬁé en

position 5 dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse.

Conserver les acides nucléiques puriﬁés entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en

dessous de -16°C pour une conservation à long terme.

3Placement des

échantillons dans

l’instrument

Puriﬁcation de l’ADN avec QIAamp™ DNA Mini Kit (méthode manuelle)

Avant la première utilisation du kit

• Reconstitution des tampons AW1 et AW2 Buers : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du

fournisseur.

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape

suivante.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé • 200 µl d’éluat d’écouvillon

• 20 à 30 mg de tissu haché —

PBS (1X), pH 7.4 — 200 µl

ATL Buer 180 µl 180 µl

Protéinase K 20 μl 20 μl

b. Vortexer pendant 15 secondes.

c. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou à 56°C pendant 16–18 heures.

1Lyse et homogénéisation

des échantillons

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 11

1Lyse et

homogénéisation des

échantillons (suite)

d. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire diminuer la

condensation.

e. Ajouter 200 µl de tampon AL Buer, puis vortexer pendant 15 secondes.

f. Incuber à 70°C pendant 10 minutes.

g. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement.

h. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis

centrifuger rapidement pour recueillir le contenu.

a. Insérer une colonne QIAamp™ DNA Mini Kit dans un tube collecteur, puis transférer la totalité du

volume de l’échantillon dans la colonne.

b. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 15 000 × g pendant 1 minute.

c. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

2Liaison de l’ADN à la

colonne

a. Ajouter 500 μl de tampon AW1 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

15 000 × g pendant 1 minute.

b. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

c. Ajouter 500 μl de tampon AW2 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

15 000 × g pendant 1 minute

d. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

e. Centrifuger à 15 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane.

f. Jeter le tube collecteur.

g. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon

AE Buer.

h. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute.

i. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne.

L’ADN puriﬁé se trouve dans le microtube.

Conserver l’ADN puriﬁé entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour

une conservation à long terme.

3Lavage et élution de l’ADN

Puriﬁcation de l’ADN avec le kit NucleoSpin™ Tissue (méthode manuelle)

Avant la première utilisation du kit

• Reconstitution du tampon B5 Buer : ajouter le volume requis d’éthanol à 96–100 % selon les recommandations du fournisseur.

• Reconstitution de la PK : ajouter le volume requis de tampon PB Buer selon les recommandations du fournisseur.

12 Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Réalisation de la procédure de puriﬁcation

a. Mélanger les composants suivants dans l’ordre indiqué, puis passer immédiatement à l’étape

suivante.

Composant Volume par échantillon testé Volume par échantillon témoin

puriﬁé

Échantillon préparé • 200 µl d’éluat d’écouvillon

• 20 à 30 mg de tissu haché —

PBS (1X), pH 7.4 — 200 µl

Tampon T1 Buer 180 µl 180 µl

Protéinase K 25 µl 25 µl

b. Vortexer pendant 1 minute.

c. Incuber à 70°C pendant 30 minutes ou à 56°C pendant 16–18 heures.

d. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement les échantillons pour faire diminuer la

condensation.

e. Ajouter 200 µl de tampon B3 Buer, puis vortexer pendant 15 secondes.

f. Incuber à 70°C pendant 10 minutes.

g. Laisser refroidir les tubes, puis centrifuger brièvement.

h. Ajouter 200 µl d’éthanol 96–100 % dans chaque échantillon, vortexer pendant 15 secondes, puis

centrifuger rapidement pour recueillir le contenu.

1Lyse et homogénéisation

des échantillons

a. Insérer une colonne de kit NucleoSpin™ Tissue dans un tube collecteur, puis transférer la totalité

du volume de l’échantillon dans la colonne.

b. Boucher la colonne, puis centrifuger l’ensemble à 11 000 × g pendant 1 minute.

c. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

2Liaison de l’ADN à la

colonne

a. Ajouter 500 μl de tampon BW Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

11 000 × g pendant 1 minute.

b. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

c. Ajouter 600 μl de tampon B5 Buer à chaque colonne, boucher la colonne, puis centrifuger à

11 000 × g pendant 1 minute

d. Jeter le tube collecteur puis positionner la colonne sur un nouveau tube collecteur.

e. Centrifuger à 11 000 × g pendant 3 minutes pour sécher la membrane.

f. Jeter le tube collecteur.

g. Positionner la colonne sur un nouveau microtube de 1,5 ml et ajouter 200 µl de tampon

BE Buer.

h. Boucher la colonne puis incuber à température ambiante pendant 1 minute.

i. Centrifuger à 6 000 × g pendant 1 minute, puis jeter la colonne.

L’ADN puriﬁé se trouve dans le microtube.

3Lavage et élution de l’ADN

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 13

3Lavage et élution de

l’ADN (suite)

Conserver l’ADN puriﬁé entre 2°C et 8°C pour une utilisation immédiate ou en dessous de -16°C pour

une conservation à long terme.

Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR et la RT-PCR

• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres.

– Ne pas porter les mêmes gants et la même blouse que ceux précédemment portés pour manipuler des produits ampliﬁés ou

préparer des échantillons.

• Changer systématiquement de gants en cas de doute quant à leur contamination possible.

• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des consommables dédiés pour les types suivants :

– Préparation des échantillons et conﬁguration de la réaction.

–Ampliﬁcation et analyse des produits.

• Ne pas introduire les produits ampliﬁés dans la zone pré-PCR de la réaction.

• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection ou création d’aérosols.

• Maintenir les composants et les réactifs fermés dans la mesure du possible.

• Utiliser une pipette à piston ou des pointes de pipette résistant aux aérosols.

• Nettoyer régulièrement les paillasses et équipements de laboratoire avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou une solution de

décontamination ADN.

14 Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Annexe A Puriﬁcation avec l’instrument KingFisher™ Duo Prime ou KingFisher™ mL

Suivre cette procédure pour la puriﬁcation avec MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit à l’aide de l’instrument KingFisher™ Duo

Prime ou KingFisher™ mL.

Matériels requis non fournis

Tableau 8 Matériels requis pour le traitement avec les instruments KingFisher™ Duo Prime et KingFisher™ mL

Article Source[1]

Consommables pour l’instrument KingFisher™ Duo Prime

KingFisher™ Duo Pack Combi pour plaque Microtiter 96 Deepwell (peignes, plaques et barrettes

d’élution pour 96 échantillons) 97003530

KingFisher™ Duo Elution Strip (pack de 40)[2] 97003520

KingFisher™ Duo Peigne à 12 pointes pour plaque Microtiter 96 Deepwell (pack de 50)[2] 97003500

KingFisher™ Flex Microtiter Deepwell 96 plaques[2] 95040460

Consommables pour l’instrument KingFisher™ mL

KingFisher™ mL Tubes et peignes (pour 240 échantillons) 97002141

KingFisher™ mL Peigne (800 unités) 97002111

KingFisher™ mL Tube (20 x 45 unités) 97002121

[1] Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. « PFL » indique que le matériel est disponible sur fisherscientific.com ou auprès d'un autre grand

fournisseur de laboratoire.

[2] Inclus dans le pack KingFisher™ Duo Combi (Réf. 97003530).

Procédure de puriﬁcation

Remarque : Quand le protocole de traitement est réalisé à l’aide d’un instrument KingFisher™ mL, mélanger les échantillons par

aspiration-refoulement. Ne pas utiliser d’agitateur de plaques avec les barrettes de tubes requises par l’instrument.

1. Suivre le protocole, de la préparation du lysat d’échantillon au mélange des échantillons avec les billes et la solution de lyse.

Remarque : Ne pas préparer les plaques ou les tubes pour le traitement avant d’avoir préparé les échantillons.

Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit 15

2. Ajouter les MagMAX™ CORE Wash Solutions et MagMAX™ CORE Elution Buer aux emplacements indiqués, selon votre instrument.

Tableau 9 Conﬁguration de la plaque : Instrument KingFisher™ Duo Prime

ID de la ligne Ligne sur la plaque Type de plaque Réactif Volume par puits

Échantillon A Deep Well Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon

Lavage 1 B MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Lavage 2 C MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution[1] Barrette de tubes

séparée[2] Barrette d’élution MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne H Deep Well Placer un peigne protecteur dans la plaque.

[1] S’assurer que la barrette d’élution est placée dans le bon sens dans le bloc d’élution.

[2] Placée sur l’élément chauffant.

Tableau 10 Conﬁguration de la barrette de tubes : Instrument KingFisher™ mL

ID de la position Position de la

barrette de tubes Tube Réactif Volume par puits

Échantillon 1 Standard Mélange billes/lysat d’échantillon Varie selon l’échantillon

Lavage 1 2 MagMAX™ CORE Wash Solution 1 500 µl

Lavage 2 3 MagMAX™ CORE Wash Solution 2 500 µl

Élution 4 MagMAX™ CORE Elution Buer 90 µl

Peigne S/O S/O Glisser le peigne dans le support pour peigne.

3. Sélectionner le script approprié sur l’instrument (voir “Téléchargement et installation du script” en page 6).

4. Démarrer le test, puis charger les plaques préparées ou les barrettes de tubes dans l’instrument en même temps. L’instrument ne

vous invite pas à charger les éléments individuellement.

Conserver l’acide nucléique puriﬁé sur glace pour une utilisation immédiate, à -20°C pendant 1 mois maximum, ou à -80°C pour une

conservation à long terme.

Annexe B Documentation et support

Assistance à la clientèle et support technique

Visiter thermoﬁsher.com/support pour obtenir les informations les plus récentes sur les services et le support.

• Numéros de téléphone de contact internationaux

• Informations sur le support produit

– FAQ relatives aux produits

– Logiciels, correctifs et mises à jour

– Formations sur de nombreux instruments et applications

• Commandes et assistance en ligne

• Documentation produit

– Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

–Certiﬁcats d’analyse

– Fiches de données de sécurité (FDS)

Remarque : Pour obtenir les FDS relatives aux réactifs et produits chimiques d’autres fabricants, contacter ces derniers.

Garantie limitée du produit

Life Technologies Corporation et ses ﬁliales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles

sur le site www.thermoﬁsher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre

contact avec Life Technologies à l’adresse web suivante : www.thermoﬁsher.com/support.

16 Guide complémentaire de VetMAX™ Ruminant Abortion Screening Kit

Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modiﬁées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ: DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES

RESPONSABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN

RÉSULTANT.

Traduit de l’anglais, publication numéro MAN0019291 Rév. A.0.

Historique des révisions: Pub. Nº MAN0019291

Révision Date Description

A.0 29 juin 2020

Nouveau document traduit à partir d’un document en français (MAN0008873 Rév. B.0) avec les mises à jour suivantes :

• Ajout du protocole MagMAX™ CORE Nucleic Acid Puriﬁcation Kit.

•Modiﬁcations mineures de la formulation et de la mise en page pour plus de cohérence avec les documents connexes.

Informations importantes sur les licences : Ces produits peuvent être couverts par une ou plusieurs licences à usage limité. En utilisant ces produits, vous acceptez les conditions

générales de toutes les licences à usage limité.

une marque de MP Biomedicals, LLC. Mixer/Mill est une marque de SPEX SamplePrep, LLC. Precellys est une marque de Bertin Technologies. Precess 24 est une marque de Bio‑Rad

Laboratories, SA. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH. Nucleospin est une marque de MACHEREY‑NAGEL.

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12 Août 2020