3B SCIENTIFIC 1012852 [W19925] Le manuel du propriétaire

Marque: 3B SCIENTIFIC

Modèle: 1012852 [W19925]

Catégorie: Kits de montage

Taper: Le manuel du propriétaire

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Contenu de la livraison

Lemodèle„mini“estlivréavecl’équipementsuivant:

• Cuved’électrophorèseavecélectrodes deplatine anticorrosiveset connexionsde hautequalité pourles pôlespositif et

négatif.

• Bouchondesécuritéauxcâblesboulonnés.

• Deuxpeignesdegelde1,5mmd’épaisseur,comportant12dentures.

• Moded’emploi.

Avis de sécurité

• Avantdemettreenservice,liresoigneusementlemoded’emploi.

• N’utiliserquepourl’alimentationdesadaptateursdecourantcontinuconformesàlaCE.

• Avantd’enleverlebouchondesécurité,ilfautimpérativementdéconnecterlacuved’électrophorèsedel’adaptateur.

• Nejamaisplacerlebouchondesécuritésurdessurfaceshumides.

• Al’arrêt,lacuved’électrophorèsedoitêtredéconnectéedel’adaptateur.

• Nepasdépasserl’ampérageetlevoltagemaximalprévuspourlacuve(150mA,120V).

• Respecterlahauteurderemplissagemaximaledutampond’électrophorèse.

Facilités techniques

Danslecasdelacuved’électrophorèse„mini“,ils’agitd’unmodèle„mini“,danslequellegelestdirectementcoulédansla

cuve;dansl’espaceencadréparlesbâtonsplastifiésblancsaufonddelacuve.

Lacuvedegeldisposed’unfondperméableauxUV,cequipermetdesuivrefacilementledéroulementdel’électrophorèse

parlebiaisdurayonnementUVdudessous,pourvuquedescolorantsfluorescentssoientdéjàemployéspendantlecourant

dugel.

Bienentendu,ilestpossibled’enleverlegelpourdocumenterdescolorationsaprèslecourant.

Pour toutes manipulations précitées, veillez à ne pas utiliser un rayonnement UV d’une longueur d’onde supérieure à

300 nm.UnrayonnementUVdur(<300nmdelongueurd’onde)porteatteinteàlacuve,augeletauxacidesnucléiques.S’il

s’agituniquementdedistancesd’isolementcourtes,ilestpossibled’utiliserlesdeuxpositionsdespeignes.

Ilyauradeuxfoisplusdepochesd’essaiàvotredisposition.

Garantie

Lefabricantgarantitlerecollagefidèledelacuved’électrophorèseavantlalivraisonetl’adéquationauxstandardsdesécu-

ritéenvigueur.Lorslaréception,veuillezvérifierl’intégralitéetl’intégritédelalivraison.Danslecasd’unelivraisondéfec-

tueuseouendommagée,veuillezcontacterimmédiatementleservicederéclamationde3BScientific.

Lefabricantaccordeunegarantiede24moispourlacuveàélectrophorèse,danslamesureoùlacuveestutiliséeconfor-

mémentau moded’emploi. Leproduit nesera pasremplacéou réparégratuitements’il fait l’objetd’une utilisationnon-

conforme.Lefabricantnepourraenaucunêtretenupourresponsabledeséventuelsdommagesrésultantd’uneutilisation

non-conformedelacuveàélectrophorèse.

Laresponsabilitédufabricantnepourraêtreengagéeniencasdenégligencegraveouintentionnelle,nipourdesdommages

résultantd’uneatteinteàlavie,aucorpsouàlasanté.

Selonunretourd’expérience,lesdeuxélectrodesdeplatinetiennentdurantplusieursannéeslorsd’unemanipulationadé-

quate.Lesdommagesapparaissentd’ordinaireparletruchementdedestructionmécanique(brosseàvaisselle)oude„poisons

deplatine“commelephosphore,boreoulesmétauxlourds(plomb,zincetc.).Parconséquent,lesélectrodesdeplatinesont

excluesdetoutegarantie.Pourpouvoirinaugurersansdélaimajeurdesdéveloppementséventuels,leproducteurseréserve

ledroitdechangerdepetitsdétailstechniquesetoptiquessansannoncepréalable.

Indications d’emploi générales

Couler le gel d’agarose

1. Revêtirlevêtementprotecteur,mettreleslunettesprotectricesetpréparerlesgantsdeprotectionpourl’échauffementde

ladissolutiondugeld’agarose.

Cuve d’électrophorèse „mini“

Français

2. Enleveravecprécautionlebouchondesécuritédelacuved’électrophorèse.

3. Pourlapréparationdeladissolutiondegel,seulel’utilisationd’agarosesappropriésetdetamponsd’électrophorèsecon-

formesestrecommandée.Pourlaproductiondeladissolutiondegeld’agarose,peserlaquantitéd’agarosecorrespondante

dansunepetitefioleErlenmeyer,ajoutersuffisammentdutampond’électrophorèseetunagitateurchauffant.Noterlepoids

delafioleErlenmeyerremplie,pourquedespertes,duesàl’ébullition,puissentêtrecompenséesparl’ajoutdeH2O(distillé).

Decettefaçon,ladissolutiondugelcomportelaconcentrationd’agaroseprévue.Pourdissoudrecomplètementl’agarose,

placerl’Erlenmeyeraufouràmicro-ondesoualternativementfairechaufferl’Erlenmeyersuruneplaquechauffanteàchaleur

moyenne,enagitantdetempsentemps.L’échauffementdanslefouràmicro-ondesdevraitêtred’unecourtedurée,mais

doitêtrerefaitplusieursfois.Entretemps,puiserl’Erlenmeyer(Attention:porterdesgantsdesécurité,deslunettesprotec-

tricesetfaireattentionauretardàl’ébullitionéventuelle)etagitercirculairementladissolutiondegel.Puisremettredansle

fouràmicro-ondesetrefairetoutleprocessus3-4foisjusqu’àquel’agarosesoittotalementdissout.

4. Avantdecoulerlegel,laisserrefroidirladissolutiondegelendessousde60°C.Puiscoulerladissolutiondegeldansla

nichesetrouvantentrelesdeuxbâtonsplastifiésblancssurlefonddelacuve,sansproduiredebulles(capacité:environ

40ml).Puis,utiliserlepeigne(oulesdeuxpeignes).Faireattentionqu’iln’yaitpasdebullesauxmargesdelaniche.Les

gelsd’agarosestandardfigentàtempératureambiantedansuntempsde20minutesenviron.

5. Recouvrirlegeld’agarosefigéde3mmdutampond’électrophorèse,pourqu’ilnes’assèchepas.Retirersoigneusementle

peigne,puischargerlegel.Legelemballédansdutamponpeutêtreconservépendantplusieursjours,aumieuxavecle

peigneplacé,avantqu’ilneperdetropd’eauparévaporation(couvrirdefilmalimentaire).

Chargement des gels d’agarose et de l’électrophorèse

1. Legeld’agarosecomplètementfigéestàrecouvriravecdutampond’électrophorèsejusqu’’àcequelahauteurderemplis-

sagemaximaledutampon(„FillLine“)soitatteinte.

2. Retirersoigneusementlepeigneenl’agitantavecprécautionpuisledégagerenletenantdroitverslehaut.

3. Maintenant,lespochesdegelpeuventêtrechargéesdeséchantillonspréparés.Ceséchantillonssontàadditionnerautam-

pondechargedugel,quifaitaugmenterlepoidsspécifiquedeséchantillonsetfaitalorsbaisserleséchantillons,étalés

parunepipettemicro,danslespoches.(partietampondechargedugel/tampond’échantillon).

4. Auchargementdespochesdegel,immergeravecprécautionlebecdelapipettemicrodanslapocheetfairesortirdouce-

mentl’échantillon.Nepasendommagerlefonddelapoche.

5. Ilestraisonnablequedesdébutantsétudientcetteétapeenutilisantdes„échantillonsd’entraînement“quisecomposent

uniquementd’H2Oetdutampondechargedegel.

6. Pourladéterminationdetailledesfragmentsd’ADNséparés,ilfautappliquersurchaquegelaumoinsunstandarddetail-

le.

7. Posermaintenantlebouchondesécuritésurlacuved’électrophorèseetbrancherlacuvesuruneunitédecourantappro-

priée.Prendreenconsidérationlapolarisationcorrecte.Dansunmilieubasiquejusqu’àneutre,lesacidesnucléiquessont

chargésnégativementetvontsedéplaceràl’anode(pôlerouge).

8. Allumerlasourcedetensionetprocéderàl’électrophorèsesurunvoltageapproprié(80–120V).Ilestmaintenantpos-

sible d’observer le déroulement de l’électrophorèse à l’aide ducolorant se trouvant dans letampon de charge du gel.

Ilest récurrentdefaireintervenir dansce tamponles colorantsbleu debromophénol oude xylènecyanole.Le com-

portementlorsde lacourse,aussi appeléecomigrationpar rapportaux fragmentsd’ADNdépenddu typed’agaroseet

dutampon d’électrophorèse.Pourune premièreorientation: lebleu debromophénolse comportedans 1xde tampon

d’électrophorèseTAEetungeld’agarosestandardde1%commeunfragmentd’ADNd’unetaillede650pairesdebases.

Dansdesconditionségales,lexylènecyanolesecomportecommeunfragmentd’unetaillede5000pairesdebases.

Coloration des acides nucléiques

Commeilexisteplusieurspossibilitéspourcolorerdesacidesnucléiques,nousattironsvotreattentionsurlalittératurespécia-

liséecorrespondante(Sambrooket.al.,1989).

Evaluation / Documentation

Desdéterminationsdetailledesfragmentsd’acidesnucléiquespeuventêtreeffectuéesparlacomparaisonavecdesfragments

dumarqueurdetaille.Unedescriptiondétailléedecetteprocéduresetrouveparexempledanslelivrespécialisé„Molekulare

Genetik“R.Knippers(2008).

Nettoyage et soin

Attention:Déconnecterlacuved’électrophorèsedel’unitédecourantavantlenettoyage.

Ilconvientde nettoyerlacuve d’électrophorèseet lespeignesaprèschaqueutilisationavecdel’eautiède.Sinécessaire,y

ajouterunpeudeliquidevaisselle.Nepasutiliserdesbrossesàvaisselle,pouréviterl’endommagementdesélectrodesde

platine.Lelavagedelacuved’électrophorèsepeutsefaireavecdel’eaudistilléeoudécalcifiéeafind’éviterlaformationde

calcaire).

Nejamaislaisserlacuved’électrophorèsecrasseusependantdesheures,voirependanttouteunenuit.Ilpeutseformerdes

tracesdesaletérésultantdesrestesdugeloudutamponséché,quiserontdifficilesàenlever.

Attention:Sipossible,tenirlesconnexionsélectriquesàl’écartdel’eau.Encasdecontactavecdel’eau,lesessuyersoigneuse-

mentavecuntorchondouxouleslaissersécheràl’air.Nepasutiliserdepapier,quiserévèlesouventêtretropduretpourrait

alorscauserdeségratignures.Nepasnonplussécherausèche-cheveux;l’airchaudpeutdétériorerlesconnexions,lesvissa-

gesetlematérielacrylique.

Attention:N’utiliserpourlenettoyagenidel’éthanol,nid’autressolvantsorganiques.Ceux-cipeuventcréerdesfissures,des

brisuresoud’autrestransformationsdumatérielindésirables.

Matériaux nécessaires et recettes

Tampon de l’électrophorèse

Letampond’électrophorèsemobiliselesionsnécessairespourleprocessusdel’électrophorèseetprovoqueunpHconstant,

pourquelesacidesnucléiquescomportentlachargenettevoulue.Lesacidesnucléiquessontchargésnégativementdansun

milieubasiqueàneutre.Normalement,lestamponsd’électrophorèsecontiennentdescomposantesquipréserventlesacides

nucléiquesdedégradation,parexemplel’EDTAquicomplexelescationsdivalentsetinhibitelesADNases.

Ici,ilestquestiondutamponTAEcourantpourl’électrophorèsed’ADNsousdesconditionsnon-dénaturantes.

TAEdésigneTris,Acétate,EDTA.

Letamponpeutêtrepréparéindépendammentoubienêtrecommandéauprèsde3BScientificcommeconcentrédetampon.

Agarose, volume et concentration de gel

Bienqu’ilexistedesagarosesdifférents,laplusgrandeimportanceestmisesurlecomptedel’agarosestandard.Pourcouler

legeld’agarosedanslacuveprésente,40mldedissolutiondegelsontnécessaires.Ilestrecommandabledepréparerunpetit

peuplusdedissolutiondegel,parcequ’ilyatoujoursundépôtrestantdanslacuvedepréparation.Celadépenddelacon-

centrationd’agarosedanslegel,lesmoléculesdetailledifférentessontséparéesdefaçonoptimale,commeexposédansle

tableauci-dessous.

Pouvoir de séparation optimal d’ADN linéaire, double brin, selon la concentration d’agarose du gel.

Concentration d’agarose (%) Agarose (g) Tampon (ml) Gamme de tailles idéales (kbp)

 0,5 0,25 50 1–15

 0,7 0,35 50 0,8–10

 1,0 0,5 50 0,5–7

 1,2 0,6 50 0,3–6

 1,5 0,75 50 0,2–4

 2,0 1,0 50 0,1–3

Tampon de charge du gel

Leséchantillonsàanalysersontmélangésavecuntampondechargedugelappropriéavantl’applicationdugel.Cestampons

dechargedugel contiennentnon seulementdescolorantspourrendreperceptibleàlavueleprocessusde laséparation,

maisaussidelaglycérine,saccharoseetd’autresélémentssemblablespourqueleséchantillonsdeviennentpluslourdsque

letampond’électrophorèseet baissentfacilementdansles pochesde gelpendantl’application deséchantillons. Souvent,

lebleu debromophénolouxylènecyanoleenqualité decolorantssont employésdans lestamponsde chargedu gel.Les

facteursaffectantlamigrationdesfragmentsd’ADNdoublebrinsontletyped’agarose,laconcentrationdugeletletampon

d’électrophorèse.

Français

L’échelle de marqueur de taille moléculaire

Uneéchelledemarqueurdetailled’ADNestappliquéesurchaquegelaumoinssurunetrace,pourpouvoirmesurerleséchantil-

lons.Cesmarqueursdetailled’ADNconsistentenfragmentsd’ADNdetailleconnue.

Coloration des acides nucléiques

DaesverschiedeneMöglichkeitenderAnfärbungvonNukleinsäurengibt,wirdandieserStelleaufdieeinschlägigeFachliteratur

verwiesen(Sambrocket.al.,1989).

Konformitätserklärung

Commeilyadesméthodesdifférentesdecolorationdesacidesnucléiques,nousattironsvotreattentionsurlalittératurespécia-

liséecorrespondante(Sambrocket.al.,1989).

Littérature

Ausubel,FrederikM.etal.(Ed.),(2005).ShortProtocolsinMolecularBiology,

ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley-VCH.

Knippers,R.(2008).MolekulareGenetik,ThiemeVerlag,Stuttgart.

Sambrook,J,Fritsc,E.F.,Maniatis, T. (1989).MolecularCloning: ALaboratory Manual.ColdSpring HarborLaboratory Press,

NewYork.

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