Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430 Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430

Taper: Mode d'emploi

PrioCHECK® FMDV type O

Test ELISA pour la détection in vitro des anticorps spécifiques du sérotype O du Virus de la Fièvre aphteuse

dans le sérum du bétail, des moutons, des chèvres et des porcs

Coffret de 2 plaques pour 176 échantillons

©Prionics AG

Version 1.1_f

Pour diagnostic in vitro uniquement

Usage strictement vétérinaire

Stocker à 5±3°C

Produit No.: 7610430

Introduction

La fièvre aphteuse est considérée comme la maladie

animale qui génère le plus de pertes économiques

dans le monde. La maladie hautement contagieuse

affecte tous les animaux biongulés et est très répan-

due dans le monde entier.

Le test de référence international pour détecter les

anticorps est le test de neutralisation du virus (Manuel

de l'OIE), mais sa réalisation est délicate et il doit être

effectué dans un laboratoire de haute sécurité. Diffé-

rents tests ELISA ont donc été développés, mais la

plupart d'entre eux utilisent des sérums polyclonaux,

sont spécifiques d'une seule espèce et sont longs à

réaliser. Ils présentent donc des limites du point de

vue de leur fiabilité pour le dépistage de masse et de

la reproductibilité des résultats. PrioCHECK® FMDV

type O utilise des anticorps monoclonaux spécifiques

du bétail, des porcs, des chèvres et des moutons. Le

test est conçu pour être réalisé avec un minimum

d'étapes de réaction. Il est adapté au dépistage de

masse et peut être utilisé sur des automates ELISA.

Principe du test

PrioCHECK® FMDV type O est un test ELISA qui

détecte les anticorps spécifiques du sérotype O de la

fièvre aphteuse. La réaction entre l'antigène de type O

du virus de la fièvre aphteuse et un anticorps mono-

clonal spécifique est bloquée par les anticorps spécifi-

ques présents dans l'échantillon de sérum.

Les barrettes sont recouvertes d'antigène de type O

du virus de la fièvre aphteuse, non infectieux. Du

tampon ainsi que du sérum non dilué sont déposés

dans les puits. La plaque est incubée à T° ambiante

(22±3°C) puis lavée. Le conjugué, qui est un anticorps

monoclonal marqué à la peroxydase, est ensuite

distribué dans tous les puits et la plaque est incubée à

22±3°C. Après lavage des puits, la solution de subs-

trat chromogène (TMB) est ajoutée. Au bout de

d'incubation, le développement de la coloration est

stoppé et la densité optique (DO) est mesurée à 450

nm.

Composition du coffret

Le coffret PrioCHECK® FMDV type O, peut être stocké

à 5±3°C jusqu'à la date de péremptio. La durée de

conservation des produits du coffret, une fois qu'ils

sont dilués, ouverts ou reconstitués, est mentionnée

dans le chapitre s'y référant (voir ci-dessous). Les

informations sur les risques chimiques sont données

dans le paragraphe « Consignes de Sécurité et Phra-

ses de Risque et de Sécurité » (Annexe II).

Composant 1

Plaque de microtitration

Deux plaques de barrettes sécables.

Composant 2

Conjugué (30x)

(concentré 30X, à diluer avant utilisation)

Un flacon contenant 2,5 ml de conjugué.

Le conjugué dilué n’est pas stable, à préparer juste

avant l’utilisation.

Composant 3

Tampon de dilution (5x)

(concentré 5x, à diluer avant utilisation).

Un flacon contenant 60 ml de tampon de dilution.

Conservation du tampon de dilution 1X : 4 heures à

(22±3°C).

Composant 4

Sérum de cheval (lyophilisé)

(A reconstituer et diluer juster avant utilisation)

Un flacon contenant 3,5 ml de sérum de cheval.

Conservation du serum de cheval reconstitué : jusqu’à

la date de péremption à -20°C.

Composant 5

Eau déminéralisée

Un flacon contenant 10 ml d'eau déminéralisée.

Composant 6

Liquide de lavage (200x)

(concentré 200x, à diluer avant utilisation).

Un flacon contient 60 ml de liquide de lavage.

Conservation de la solution de lavage: 1 semaine à

22±3°C.

Composant 7

Sérum de contrôle 1 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 0,5 ml de sérum de contrôle 1.

Composant 8

Sérum de contrôle 2 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 0,5 ml de sérum de contrôle 2.

Composant 9

Sérum de contrôle 3 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 0,5 ml de sérum de contrôle 3.

Composant 10

Sérum de contrôle 4 (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 0,5 ml de sérum de contrôle 4.

Composant 11

Substrat chromogène (TMB) (prêt à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de substrat chromogène

(TMB).

Composant 12

Solution d'arrêt (prête à l'emploi)

Un flacon contenant 60 ml de solution d'arrêt.

Autres composants du coffret:

- Notice d'utilisation

- 1 couvercle pour couvrir les barrettes pendant les

périodes d'incubation

- Certificat d'analyse

Equipement nécessaire mais non

fourni

Equipement général:

Equipement de laboratoire aux normes de sécurité

nationales.

Analyse des résultats:

Lecteur de microplaques : Multiscan EX ou équivalent.

Le lecteur doit être équipé d'un filtre permettant de lire

les plaques à 450 nm.

Equipement optionnel:

Laveur de microplaques: Tecan EIA Tray

Washer ou équivalent.

Mode opératoire

Précautions

Les recommandations nationales concernant la mani-

pulation d'échantillons animaux doivent être appli-

quées de façon stricte. Le test PrioCHECK® FMDV

type O ne doit être réalisé que dans les laboratoires

équipés pour cela.

Les échantillons doivent être considérés comme

potentiellement infectieux. Tout matériel en contact

avec ces échantillons doit être considéré comme

potentiellement contaminé.

Les informations sur les risques chimiques sont

données dans le paragraphe « Consignes de Sécurité

et Phrases de Risque et de Sécurité » (Annexe II).

Remarques

Pour obtenir des résultats optimums avec Prio-

CHECK® FMDV type O, les précautions suivantes

doivent être prises :

 Le mode opératoire doit être rigoureusement

suivi

 Tous les réactifs du coffret doivent être ramenés

à T° ambiante (22±3°C) avant utilisation

 L'embout des pipettes doit être changé chaque

fois qu'un nouvel échantillon ou réactifs est pré-

levé

 Des réservoirs séparés doivent être utilisés pour

chaque réactif.

 Les composants du coffret ne doivent pas être

utilisés après la date de péremption ou si un

changement dans leur aspect est noté

 Les réactifs provenant de coffrets portant des

numéros de lots différents, ne doivent pas être

associés dans une même série de tests

 Le test doit être réalisé avec de l'eau déminérali-

sée ou une eau équivalente

SOLUTIONS A PREPARER A L'AVANCE

Tampon de dilution 1X

Diluer le tampon de dilution (concentré 5x) (Compo-

sant 3) dans de l'eau déminéralisée (1 volume de

tampon concentré + 4 volumes d'eau déminéralisée).

Peut être conservé plus de 4 heures à 22±3°C.

Sérum de cheval

Ramener le flacon à 22±3°C et reconstituer1le sérum

de cheval (Composant 4) avec 3.5 ml de l'eau déminé-

ralisée (Composant 5). Le sérum reconstitué peut être

conservé à -20°C jusqu’à péremption.

Tampon ELISA

Ajouter le sérum de cheval au tampon de dilution pour

obtenir une concentration finale de 5% (v/v); ex. pour 2

barrettes préparer 3.5 ml (ajouter 175 µl sérum de

cheval à 3.325 ml de tampon de dilution 1X). Peut être

conservé plus de 4 heures à 22±3°C.

Diluton du conjugué

Diluer le conjugué (30x) (Composant 2) 1/30 dans du

tampon ELISA frais; ex. pour 2 barrettes préparer 1.8

ml (ajouter 60 µl de conjugué (30x) à 1.74 ml de

tampon ELISA ).

Note: Le conjugué dilué doit être préparé juste

avant l’utilisation.

Liquide de lavage

Diluer le liquide de lavage (concentré 200x) (Compo-

sant 6) dans l'eau déminéralisée. La quantité fournie

de liquide de lavage est suffisante pour préparer un

volume final de 12 litres.

Stabilité du liquide de lavage dilué: 1 semaine à

22±3°C.

1 Les réactifs lyophilisés doivent être reconstitués de la manière

- Ramener les flacons à 22±3°C.

- Tenir le flacon verticalement et le tapoter contre le plan de travail pour

s'assurer que tout le contenu du flacon se trouve au fond du flacon.

- Ouvrir le flacon soigneusement.

- Ajouter la quantité d'eau déminéralisée (Composant 5) spécifiée .

- Reboucher le flacon et laisser le lyophilisat se dissoudre.

- Agiter doucement le flacon jusqu'à dissolution complète du lyophilisat.

- Laisser le flacon reposer au moins 15 minutes à 22±3°C avant

utilisation.

- Agiter de temps en temps le flacon par retournement (en évitant la

formation de mousse).

Notice d'utilisation

PrioCHECK

FMDV type O

Remarque:

Les lavages peuvent être effectués avec un laveur

automatique ELISA. Si l'on ne dispose pas de laveur,

le lavage des plaques peut être fait manuellement

avec 200 µl de liquide de lavage par puits. Puis vider

la plaque et répéter le lavage autant de fois que

spécifié. Il n'est pas nécessaire d'égoutter les plaques

sur du papier absorbant entre les lavages. Tapoter

fermement les plaques après le dernier cycle de

lavage.

INCUBATION DES SERUMS

1.1 Distribuer 90 µl de tampon ELISA dans tous les

puits (Composant 1).

1.2 Déposer 10 µl de sérum de contrôle 1 (Compo-

sant 7) dans les puits A1 et B1.

1.3 Déposer 10 µl de sérum de contrôle 2 (Compo-

sant 8) dans les puits C1 et D1.

1.4 Déposer 10 µl de sérum de contrôle 3 (Compo-

sant 9) dans les puits E1 et F1.

1.5 Déposer 10 µl de sérum de contrôle 4 (Compo-

sant 10) dans les puits G1 et H1.

1.6 Déposer 10 µl d'échantillon dans tous les

autres puits.

1.7 Couvrir les barrettes et agiter doucement.

1.8 Incuber 60±5 minutes à 22±3°C.

1.9 Vider les barrettes après la période d'incubation

et les laver 6x avec 200 à 300 µl le liquide de

lavage. Tapoter fermement la plaque de barret-

tes après le dernier cycle de lavage.

INCUBATION AVEC LE CONJUGUE

2.1 Distribuer 100 µl de solution de travail du conj-

gué dans tous les puits.

2.2 Couvrir les barrettes et agiter doucement.

2.3 Incuber 60±5 minutes à 22±3°C.

INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT CHROMOGENE

(TMB)

3.1. Vider les plaques après incubation et laver 6 fois

avec 200 à 300 µl le liquide de lavage. Tapoter

fermement les plaques après le dernier cycle de

lavage.

3.2. Distribuer 100 µl de substrat chromogène (TMB)

(Composant 11) dans tous les puits.

3.3. Incuber 15 minutes à 22±3°C.

3.4. Ajouter 100 µl de solution d'arrêt (Composant

12).

3.5. Homogénéiser le contenu des plaques.

Remarque: Commencer à ajouter la solution d'arrêt

15 minutes après avoir déposé la solution de substrat

chromogène (TMB) dans le premier puits. Distribuer la

solution d'arrêt dans tous les puits en gardant le même

ordre et le même rythme que pour distribuer le subs-

trat chromogène (TMB).

LECTURE DU TEST ET CALCUL DES RESULTATS

4.1. Mesurer la densité optique (DO) des puits à 450

nm dans les 15 minutes suivant l'addition de la

solution d'arrêt.

4.2. Calculer la DO450 moyenne des puits A1 et B1 (=

DO450 blanc).

4.3. Calculer la DO450 corrigée de tous les échantil-

lons en soustrayant la DO450 blanc.

4.4. Calculer la DO450 moyenne des puits G1 et H1

(= DO450 max).

4.5. Le pourcentage d'inhibition (PI) du sérum de

contrôle et des échantillons est calculé selon la

formule ci-dessous.

La DO450 de chaque échantillon est exprimée en

pourcentage d'inhibition par rapport à la DO450 max.

DO450 corrigée de l'échantillon

PI = 100 - ---------------------------------------- x 100

DO450 max corrigée

INTERPRETATION DES RESULTATS

Validation des critères

5.1. La DO450 moyenne des puits A1 et B1 (= DO450

blanc) doit être <0,350.

5.2. La DO450 max doit être au moins égale à 1,000.

5.3. Le pourcentage d'inhibition moyen du sérum de

contrôle 2 doit être >60%.

5.4. Le pourcentage d'inhibition moyen du sérum de

contrôle 3 doit être<40%.

Si ces critères ne sont pas validés, les résultats de la

série de tests sont ininterprétables.

Remarque: Si la DO450 max est inférieure à 1,000, la

solution de substrat chromogène (TMB) était peut-être

trop froide au moment de son utilisation. Dans ce cas,

penser à ramener la solution de substrat à 22±3°C

avant utilisation ou incuber plus longtemps les plaques

(sans dépasser 30 minutes d'incubation).

Interprétation du pourcentage d'inhibition

PI = < 50% Négatif

Absence d'anticorps spécifiques du type O du virus de

la fièvre aphteuse dans le prélèvement.

PI = > 50% Positif

Présence d'anticorps spécifiques du type O du virus

de la fièvre aphteuse dans le prélèvement.

Annexe I

Avertissement

Les informations contenues dans cette notice sont

considérées comme complètes et exactes au moment

de leur publication. Prionics AG ne peut en aucun cas

être tenu pour responsable des dommages fortuits ou

indirects liés à l'utilisation de ce document ou en

résultant.

Responsabilité

Prionics AG garantit que ses produits sont conformes

aux caractéristiques décrites sous réserve qu'ils soient

utilisés selon les instructions fournies et dans les

délais de conservation indiqués. Prionics AG exclut

toute autre garantie, explicite ou implicite, y compris la

garantie d'aptitude à la vente ou de conformité pour

une utilisation particulière. La garantie mentionnée ici,

ainsi que les informations, spécifications et descrip-

tions des produits commercialisés par Prionics AG

figurant dans les catalogues Prionics AG ou tout autre

document, ne peuvent pas être modifiées, sauf

consentement écrit express de Prionics AG. Les

présentations orales ou écrites, ou les publications

non conformes à cette garantie ne sont pas autorisées

et sont sujettes à caution.

En cas de rupture de la garantie, l'obligation de Prio-

nics AG se limite à la réparation ou à l'échange, à sa

discrétion, du produit ou d'une partie du produit, sous

réserve que le client informe rapidement Prionics AG

de cette rupture de garantie. Au cas où la société

Prionics AG ne pourrait pas réparer ou remplacer le

produit ou une partie du produit, elle devra rembourser

au client l'intégralité des sommes perçues pour ce

produit ou pour partie de ce produit.

Prionics AG ne peut être tenu pour responsable des

dommages fortuits, particuliers ou indirects y compris

ceux résultant d'une perte économique ou d'un dom-

mage matériel subis par un client suite à l'utilisation de

ses produits.

Prionics AG et Prionics Lelystad BV sont des entrepri-

ses certifiées ISO 9001:2000.

Annexe II

Normes de Sécurité et Phrases de Risque et de Sécurité

1. Les Normes de Sécurité Nationales doivent être appli-

quées de façon stricte.

2. Phrases de Risque et de Sécurité

Composant 1

Plaque de microtitration