Thermo Fisher Scientific VetMAX European BTV Typing Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX European BTV Typing Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ European BTV Typing Kit

RT-PCR temps réel TaqMan™ pour la détection du BTV (Bluetongue Virus) de types 1, 2, 4, 6, 8, 9, 11, et 16

Référence Catalogue BTVEUG

Partie Nº 100020320 Pub. Nº MAN0008710 Rév. B.0

Technique

Espèce(s) Acides nucléiques isolés à partir des matrices Test

RT-PCR temps réel (ARN)

– 8 réactions duplex

– IPC endogène

Bovins

Petits ruminants

(ovins, caprins)

Sang (en tubes EDTA)

Rate

Avorton (rate, foie, cœur)

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

La Fièvre Catarrhale Ovine (FCO ou bluetongue en anglais) est une maladie infectieuse virale vectorielle non contagieuse des moutons,

inscrite à la liste A de l’Office International des Epizooties. Elle est due à l’infection par le virus de la bluetongue (BTV), un virus de la

famille des Reoviridae, genre Orbivirus. A ce jour, 27 sérotypes différents du BTV ont été identifiés.

Le BTV est essentiellement réputé dangereux pour les ovins : il entraine une importante morbidité ainsi qu’une forte mortalité. De

même, le virus infecte les bovins, les caprins et autres ruminants sauvages mais n’entraîne qu’exceptionnellement des manifestations

cliniques chez ces espèces (Lefèvre et Desoutter, 1998).

La transmission du virus se fait presque exclusivement par morsure infectante d’un petit diptère hématophage appartenant à la famille

des Ceratopogonidae, genre Culicoides. Il existe plus de 1400 espèces de Culicoides mais toutes ne sont pas capables de transmettre

l’infection. Le vecteur s’infecte par repas de sang pris sur animal infectant, puis multiplie le virus jusqu’à une dose nécessaire pour sa

transmission à d’autres animaux réceptifs.

Applied Biosystems™ VetMAX™ European BTV Typing Kit est un outil de diagnostic moléculaire du BTV. C’est un kit de deuxième

intention qui permet, après analyse BTV de groupe rendue positive, le typage du virus BTV1, BTV2, BTV4, BTV6, BTV8, BTV9, BTV11

et BTV16 par la technique de RT-PCR en temps réel.

Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ARN viral de chaque type du virus BTV et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC

traduit à la fois l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ARN viraux extraits à partir de sang (en tube EDTA), de rate ou d’organes d’avortons. Il est possible de réaliser les

analyses directement à partir d'ARN préalablement identifiés positifs en BTV.

Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.

Réactifs du kit et conservation

Le VetMAX™ European BTV Typing Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en

duplex des 8 types de BTV et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C.

Après première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes:

Article Description Volume

(8 × 50 réactions)

Conservation

A réception

Après première

utilisation

3 - Mix BTVEUG1 (Tube vert)

8 Mix pour RT-PCR TaqMan™. Ils contiennent chacun :

• Le système de détection pour la cible BTV(X)(1),

comprenant une sonde TaqMan™ marquée FAM™ - NFQ

(Non-Fluorescent Quencher).

• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une

sonde TaqMan™ marquée VIC™ - NFQ (Non-Fluorescent

Quencher).

• Le tampon, la reverse-transcriptase et l’enzyme de

PCR temps réel.

1000 µL chacun −30°C à −10°C −30°C à −10°C

3 - Mix BTVEUG2 (Tube jaune)

3 - Mix BTVEUG4 (Tube bleu)

3 - Mix BTVEUG6 (Tube orange)

3 - Mix BTVEUG8 (Tube blanc)

3 - Mix BTVEUG9 (Tube rouge)

3 - Mix BTVEUG11 (Tube noir)

3 - Mix BTVEUG16 (Tube violet)

4a - EPC BTVEUG (Tube marron)

External Positive Control : Contrôle positif pour les

8 génotypes BTV(X). Il se compose d’acide nucléique déjà

extrait, à dénaturer, puis à amplifier pendant la PCR

temps réel.

2 x 360 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

(1) (X) correspond au numéro du génotype (1, 2, 4, 6, 8, 9, 11, ou 16)

2 VetMAX™ European BTV Typing Kit Notice d’Utilisation

Témoins d’extraction et d’amplification

Le VetMAX™ European BTV Typing Kit contient des témoins permettant la validation de l’amplification des ARN viraux :

Contrôle 4a - EPC BTVEUG : contrôle BTV positif

Contrôle positif précédemment extrait à amplifier pendant la RT PCR temps réel.

Un résultat positif dans la plage Ct spécifiée permet la validation de l’amplification de la cible BTV par RT-PCR temps réel.

La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal

Positive Control), présent dans chaque échantillon.

Un résultat IPC positif avec une valeur compris dans l’intervalle accepté de Ct dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet

échantillon qu’il soit positif ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des

inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques puis RT-PCR temps réel.

Un résultat négatif en BTV(X) et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la

RT-PCR temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Pour chaque mix 3 - Mix BTVEUG(X), un résultat négatif pour BTV(X) et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours

de la préparation des réactions pour la RT-PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

- FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

- VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé : Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits),

microtubes ou capillaires; films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la RT-PCR temps réel est de 25 µL :

• 3 - Mix BTVEUG(X) : 20 µL par analyse

• ARN extrait : 5 µL par analyse (soit 40 µL pour les 8 génotypes). Les ARNs extraits doivent être dénaturés avant analyse.

Extraction des ARN viraux

Il est nécessaire d’isoler les ARN à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ European BTV Typing Kit, merci de

contacter le Support Technique.

Dénaturation des ARN

1. Distribuer les ARN à dénaturer dans les puits d’une plaque ou barrette PCR.

2. Boucher les puits contenant des ARN à dénaturer.

3. Chauffer pendant 3 minutes entre 92°C et 98°C dans un thermocycleur ou un bloc chauffant.

4. Maintenir les ARN dénaturés entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans de la glace pilée ou sur un bloc réfrigéré.

VetMAX™ European BTV Typing Kit Notice d’Utilisation 3

Préparation de la RT-PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres

échantillons.

2. Décongeler les tubes 3 - Mix BTVEUG(X) entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser les tubes 3 - Mix BTVEUG(X) par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Pour chaque analyse BTV(X), distribuer 20 µL de 3 - Mix BTVEUG(X) par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Pour chaque analyse BTV(X), ajouter les ARN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ARN extraits de l’échantillon et dénaturés 5 µL

Contrôle positif d’amplification

4a - EPC BTVEUG dénaturé 5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS)

NCS extrait et dénaturé

5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free 5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

Amplification par RT-PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

BTV(X)

(1)

FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

IPC BTV

VIC™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

Référence passive : ROX

™(2)

(1) Créer un détecteur BTV(X) pour chaque génotype (X) à analyser.

(2) Le fluorophore ROX™ est à renseigner obligatoirement pour l’analyse par RT-PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter. Pour les

autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par RT-PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur BTV(X) correspondant au mix 3 - Mix BTVEUG(X) distribué dans le puits et le

détecteurs IPC BTV dans chaque puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1 ×1 45°C 10 minutes

Etape 2 ×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×40 95°C 15 secondes

60°C(1) 45 secondes

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 45 secondes.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la RT-PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les

recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants pour chaque analyse BTV(X) :

Détecteur BTV(X)

Détecteur IPC BTV

Validation

EPC BTVEUG

= C

BTV(X) de 4a - EPC BTVEUG ± 3C

t(1)

< 40 ou C

> 40

(2)

RT-PCR validée

NCS Ct > 40 Ct > 40 Extraction validée

Ct > 40 Ct > 40 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

16 octobre 2020

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur BTV(X)

Détecteur IPC BTV Interprétation

< 40

< 40 ou C

> 40

BTV(X) détecté

Ct > 40

Ct < 40 BTV(X) non détecté

> 40

Ct > 40 Non validé(1)

(1) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

Si l’échantillon est non validé seulement avec certains mix :

1. Dénaturer l’ARN extrait de l’échantillon.

2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL d’ARN extrait de l’échantillon (après dénaturation) sur les mix concernés.

3. Pour chaque mix, si l’ARN dilué est positif en BTV(X) ou négatif en BTV(X) avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est

alors validé pour le mix concerné.

4. Si le résultat est toujours non validé pour certains mix, procéder à une dilution des acides nucléiques comme décrit ci-après (cas

d’un échantillon non validé pour tous les mix), mais n’appliquer cette procédure que pour les mix concernés.

Si l’échantillon est non validé pour tous les mix :

1. Diluer l’ARN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.

2. Dénaturer l’ARN dilué.

3. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution (après dénaturation).

4. Pour chaque mix, si l’ARN dilué est positif en BTV(X) ou négatif en BTV(X) avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est

alors validé pour le mix concerné.

5. Si le résultat est toujours non validé pour certains mix, renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 en tampon

PBS 1X avant extraction et re-tester sur les mix concernés.

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur

thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux

dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance

technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également

appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux

produits chimiques d'autres fabricants, contacter

chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs

produits selon les termes et conditions générales de ventes

disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/

global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous

pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web

suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008710 (français)

Révision

Date

Description

B.0 16 octobre 2020

• Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

• Mise à jour du contrôle positif externe (EPC) (4a- EPC BTVEUG) ; les 8 contrôles positifs sont désormais mélangés et

expédiés dans un seul tube.

A.0

13 novembre 2013

Base de référence pour l’historique de révision

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