Thermo Fisher Scientific VetMAX Peste Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX Peste

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit

RT-PCR temps réel TaqMan® pour la détection du PPRV (Peste des Petits Ruminants Virus)

Référence Catalogue PPRP50

Partie Nº 100020416 Pub. Nº MAN0008850 Rév. B.0

Technique

Espèce(s) Acides nucléiques isolés à partir des matrices Test

RT-PCR temps réel (ARN)

-Duplex

-IPC endogène

Petits ruminants

(ovins et caprins)

Sang EDTA

Organes (poumon, rate, intestin, ganglions lymphatiques)

Écouvillons (oculaires et nasaux)

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection

par RT-PCR temps réel du PPRV (Peste des Petits Ruminants Virus) chez les petits ruminants : ovins et caprins.

La Peste des Petits Ruminants est une maladie hautement contagieuse (inscrite sur la liste A de l’OIE) due à un virus ARN du genre

Morbillivirus, touchant les petits ruminants domestiques et sauvages. C’est une maladie caractérisée par une propagation rapide, de

forts taux de morbidité et quelques cas de mortalité.

Chaque échantillon d’ARN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection

spécifique de l’ARN viral du PPRV et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois

l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ARN viraux extraits à partir de sang prélevé en tubes EDTA, d’organes et tissus (poumon, rate, intestin, ganglions

lymphatiques) et d’écouvillons (oculaires et nasaux).

Les protocoles complets d’extractions des ARN viraux à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.

Réactifs du kit et conservation

Le VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la

détection en duplex du PPRV et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C.

Après première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :

Article Description Volume

(50 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

3 - Mix PPR

(Tube vert)

Mix pour RT-PCR TaqMan®. Contient :

•Le système de détection pour la cible PPRV, comprenant une sonde

TaqMan® marquée FAM™ – TAMRA™.

•Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde TaqMan®

marquée VIC™ – NFQ (Non-Fluorescent Quencher).

•Le tampon, la reverse-transcriptase et l’enzyme de PCR temps réel.

2 × 500 µL

−

30°C à

−

10°C

−

30°C à

−

10°C

4a - EPC PPR

(Tube marron)

External Positive Control :

Contrôle positif en PPRV. Il s’agit d’acides nucléiques déjà extraits à

amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

90 µL

−

30°C à

−

10°C

−

30°C à

−

10°C

Témoins d’extraction et d’amplification

Le VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ARN viraux :

4a - EPC PPR : contrôle positif en PPRV

Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la RT-PCR temps réel.

Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible PPRV par RT-PCR temps réel.

2 VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Notice d’Utilisation

La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal

Positive Control), présent dans chaque échantillon.

Un résultat IPC positif avec une valeur conforme dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif

ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques puis RT-PCR temps réel.

Un résultat négatif en PPRV et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et de la RT-PCR

temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la RT-PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Un résultat négatif pour PPRV et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des réactions pour la

RT-PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la RT-PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé :

– Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits), microtubes ou capillaires

– Films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la RT-PCR temps réel est de 25 µL :

• 3 - Mix PPR : 20 µL par analyse

• ARN extrait : 5 µL par analyse

Extraction des ARN viraux

Il est nécessaire d’isoler les ARN à partir des échantillons pour l’analyse par RT-PCR temps réel.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit,

merci de contacter le Support Technique.

Préparation de la RT-PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres

échantillons.

2. Décongeler le tube 3 - Mix PPR entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser le tube 3 - Mix PPR par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix PPR par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Ajouter les ARN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ARN extraits de l’échantillon 5 µL

Contrôle positif d’amplification

4a - EPC PPR 5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS)

NCS extrait 5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free 5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

VetMAX™ Peste des Petits Ruminants Virus Kit Notice d’Utilisation 3

Amplification par RT-PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

PPR

FAM™ TAMRA™(1)

IPC PPR

VIC™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

Référence passive : ROX

™(1)

(1) Les fluorophore TAMRA™ et ROX™ sont à renseigner obligatoirement pour l’analyse par RT-PCR temps réel si le thermocycleur est capable de les détecter.

Pour les autres thermocycleurs, l’absence de détection de ces fluorophores ne remet pas en cause l’analyse par RT-PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur PPR et le détecteur IPC PPR dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de RT-PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1

×1 45°C 10 minutes

Etape 2

×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×45 95°C 15 secondes

60°C(1) 1 minute

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la RT-PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la RT-PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les

recommandations ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur PPR Détecteur IPC PPR Validation

EPC PPR

Ct = Ct QC PPR de 4a- EPC PPR ± 3Ct(1) Ct < 45 ou Ct > 45(2) RT-PCR validée

NCS

Ct > 45 Ct > 45 Extraction validée

Ct > 45 Ct > 45 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur PPR

Détecteur IPC PPR Interprétation

< 45

Ct < 45 ou Ct > 45 PPRV détecté

> 45

Ct < 45 PPRV non détecté

> 45

Ct > 45 Non validé(1)

(1) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ARN de l’échantillon non validé au 1:5 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse RT-PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ARN dilué est positif en PPRV ou négatif en PPRV avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.

4. Si l’ARN dilué est négatif en PPRV avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce cas,

renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:2 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

23 mai 2017

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur

thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux

dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance

technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également

appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux

produits chimiques d'autres fabricants, contacter

chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs

produits selon les termes et conditions générales de ventes

disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/

global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous

pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web

suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

SABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.

Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008850 (français)

Révision

Date

Description

B.0

23 mai 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

20 novembre 2013

Base de référence pour l’historique de révision

Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de

diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.

Licence à Usage Limité N° 488 : Pirbright Institute. Avis aux acheteurs : développé en collaboration avec le Pirbright Institute du Royaume-Uni (anciennement, Institute for

Animal Health du Royaume-Uni).

TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.