Thermo Fisher Scientific VetMAX IBR gB Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX IBR gB Kit

Taper: Mode d'emploi

Pour usage en laboratoire.

GUIDE COMPLEMENTAIRE

VetMAX™ IBR gB Kit

Protocoles de purification d'acides nucléiques

En association avec la Référence Catalogue IBRP50

Partie Nº 100021164 Pub. Nº MAN0008781 Rév. B.0

Espèce(s)

Isolation des acides nucléiques à partir des matrices

Test

Bovins

Ovins

Caprins

Ecouvillons nasaux

Lavages pulmonaires

Semences

Individuel

Sommaire

Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques ............................................................................... 2

Contenu de ce manuel .................................................................................................................................................................................. 2

Choix des échantillons ................................................................................................................................................................................. 2

Conservation des échantillons ..................................................................................................................................................................... 2

Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit ............................................................................................................. 3

Protocoles d’extraction de l’ADN ................................................................................................................................................................. 3

Extraction de l’ADN ......................................................................................................................................................... 4

Préparation des échantillons avant extraction ........................................................................................................................................... 4

Extraction avec le MagVet™ Universal Isolation Kit ..................................................................................................................................... 5

Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit ................................................................................................................................................... 6

Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue ................................................................................................................................................... 7

Documentation et support ............................................................................................................................................... 8

Service clientèle et assistance technique ................................................................................................................................................... 8

Garantie produit limitée ............................................................................................................................................................................... 8

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

2 VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire

Purification d'acides nucléiques à partir d'échantillons biologiques

Contenu de ce manuel

Ce manuel a pour objectif de présenter des protocoles de purification des ADN viraux de BVH1 (bovine herpesvirus 1) compatibles

avec Applied Biosystems™ VetMAX™ IBR gB Kit.

Choix des échantillons

Matrice Type d’analyse Quantité requise et matériel de prélèvement

Ecouvillons nasaux Individuelle Ecouvillon stérile dans son étui de transport

Liquides divers Individuelle

Volume minimal préconisé : 5 mL de liquide de lavage

broncho-alvéolaire ou d’aspiration trans-trachéale

Semences Individuelle 5 mL de semence

Conservation des échantillons

Il est nécessaire de s’assurer de la qualité des échantillons avant leur entrée dans le processus analytique.

Ecouvillon

Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 24 heures après prélèvement.

Après élution de l’écouvillon, utiliser directement l’éluât pour réaliser la purification des acides nucléiques. Placer le reste de l’éluât en

dessous de −16°C pour une conservation jusqu’à 1 an ou en dessous de −70°C pour une conservation au-delà de 1 an.

Lavage broncho-alvéolaire ou aspiration trans-trachéale

Suite au prélèvement, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu'à utilisation, dans un délai maximum de 48 heures après prélèvement. Après

utilisation ou passé le délai de 48 heures, congeler en dessous de −16°C pour conservation jusqu'à 1 an.

Semences

Selon le type de semence :

• Si la semence est pure et fraîche, maintenir entre 2°C et 8°C jusqu’à utilisation, dans un délai maximum de 8 jours après prélèvement.

• S’il s’agit d’une semence commerciale, maintenir dans les conditions de conservation (température et durée) préconisées par le

fournisseur jusqu’à utilisation.

VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire 3

Matériel et réactifs requis pour l’analyse non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

Matériel et réactifs nécessaires à la préparation des échantillons pour analyse

• Poste de sécurité microbiologique (PSM) de type II

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Un vortex ou équivalent

• Une centrifugeuse pour microtubes de 1.5 mL et 2 mL

• Balance de précision

• Un bloc chauffant ou un incubateur permettant la réalisation des incubations à 70°C.

• Microtubes DNase/RNase-free de 1.5 mL et 2 mL

• Tampon PBS 1X ou milieu MEM

• Eau DNase/RNase-free

Kits, réactifs et matériels pour l’extraction et la purification des ADN des échantillons

Tous les matériels et réactifs requis pour la préparation des échantillons pour analyse sont susceptibles d’être utilisés pour cette étape.

S’assurer en plus de disposer des éléments suivants :

• Ethanol 96–100% ou éthanol 80% selon l’extraction réalisée

• Extraction automatisée en billes magnétiques :

– MagVet™ Universal Isolation Kit (Réf. MV384)

– Automate d’extraction : renseignements disponibles sur demande au Support Technique.

• Extraction manuelle sur colonnes de silice en format individuel :

– QIAamp™ DNA Mini Kit (QIAGEN™) ou kit NucleoSpin™ Tissue (MACHEREY-NAGEL)

– Une centrifugeuse pour microtubes

Protocoles d’extraction de l’ADN

Kits d’extraction recommandés

Ecouvillons nasaux, lavage

broncho-alvéolaire, aspiration

trans-trachéale

MagVet™ Universal Isolation Kit

QIAamp™ DNA Mini Kit

NucleoSpin™ Tissue

Semences QIAamp™ DNA Mini Kit

NucleoSpin™ Tissue

4 VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire

Extraction de l’ADN

Préparation des échantillons avant extraction

Ecouvillons

Préparation pour extraction en automates

1. Déposer sur l’écouvillon placé dans son tube de transport 1 mL de PBS 1X.

2. Vortexer l’écouvillon dans son tube de transport.

3. Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi pour bien l’essorer. Centrifuger 10 minutes à 1500 × g.

4. Eliminer le surnageant en prenant soin de conserver environ 100 µL pour ne pas éliminer les cellules. L’extraction sera effectuée

sur ce culot cellulaire resuspendu dans 100 µL de surnageant.

Préparation pour extraction en colonnes

1. Déposer sur l’écouvillon placé dans son tube de transport, 500 µL de PBS 1X.

2. Vortexer l’écouvillon dans son tube de transport.

3. Enlever l’écouvillon en l’écrasant sur la paroi pour bien l’essorer. L’extraction sera effectuée sur ces 200 µL d’éluât.

Liquide broncho-alvéolaire et aspiration trans-trachéale

1. Transférer le liquide (volume minimal préconisé : 5 mL) dans un tube à fond conique et centrifuger 10 minutes à 1500 × g.

2. Eliminer le surnageant en prenant soin conserver environ 100 µL de liquide pour ne pas éliminer de cellules. L’extraction sera

effectuée sur ce culot cellulaire resuspendu dans 100 µL de surnageant.

Semences

1. Transférer les semences (environ 5 mL) dans un tube à fond conique et centrifuger 5 minutes à 1500 × g. Trois phases sont ainsi

obtenues : le liquide séminal, les leucocytes et cellules épithéliales, et les spermatozoïdes.

2. Récupérer jusqu'à 100 µL de la phase contenant les leucocytes et cellules épithéliales.

Ce « culot » peut être utilisé immédiatement pour purification des acides nucléiques ou conservé 1 mois en dessous de −16°C ou

plusieurs mois en dessous de −70°C.

VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire 5

Extraction avec le MagVet™ Universal Isolation Kit

Remarques

Le protocole d’extraction sur billes magnétiques présenté est utilisable indifféremment avec les automates KingFisher™ mL et

KingFisher™ 96/Flex. En effet, seul le nombre d’échantillons traités diffère.

Ce protocole requiert l’utilisation de réactifs externes au MagVet™ Universal Isolation Kit :

• La protéinase K : 20 µL de protéinase K de QIAGEN™ ou 25 µL de protéinase K de MACHEREY-NAGEL (reconstitué) par échantillon.

Ce protocole ne s’applique pas aux prélèvements de semences.

Avant de commencer

• Reconstitution de la solution NM1 : Transvaser la totalité de la solution N1 (100 mL) dans la bouteille contenant la solution M1 (25 mL),

bien vortexer. Le tampon de lyse NM1 (125 mL) ainsi obtenu est stable 1 an à température ambiante.

• Reconstitution de la solution NM2+Billes : Chaque réaction requiert 20 µL de NM_LSI_Beads et 600 µL de tampon de binding NM2. Il

est conseillé de reconstituer cette solution juste avant utilisation et de ne pas la conserver ensuite. Bien homogénéiser la solution

contenant les billes en la vortexant juste avant utilisation.

• Reconstitution de la protéinase K : Reconstituer selon les recommandations du fournisseur de la protéinase K utilisée.

• Préparer et identifier le nombre de microtubes, de barrettes d’extraction et de plaques d’extraction correspondant au nombre

d’échantillons à extraire (comprenant les témoins négatifs et positifs).

Protocole

1. Réaliser la lyse des échantillons dans des microtubes 1.5 mL ou 2 mL, comme décrit ci-dessous :

Liquide broncho-alvéolaire,

aspiration trans-trachéale

NCS

Solution de lyse

180 µL de NM1

+ 20 µL de protéinase K QIAGEN™

ou 25 µL de protéinase K MACHEREY-NAGEL

180 µL de NM1

+ 20 µL de protéinase K QIAGEN™

ou 25 µL de protéinase K MACHEREY-NAGEL

Prise d’essai 100 µL de culot cellulaire resuspendu 100 µL de PBS 1X

2. Incuber 30 minutes à 70°C.

3. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.

4. Préparer les consommables pour la série d’extraction :

• Pour l’automate KingFisher™ mL : sortir le plateau coulissant de l’automate et positionner les barrettes d’extraction dessus,

pour distribution des tampons sur paillasse.

• Pour l’automate KingFisher™ 96/Flex : les tampons seront distribués dans les plaques sur paillasse.

5. Préparer l’extraction en automate comme décrit ci-dessous :

• Dans le cas d’une extraction avec l’automate KingFisher™ mL, transférer la totalité des lysats dans les puits A des barrettes

d’extraction.

• Dans le cas d’une extraction avec l’automate KingFisher™ 96/Flex, transférer la totalité des lysats dans une plaque Deep Well

qui sera directement utilisée comme plaque 1.

Position de la barrette

ou plaque Réactifs Échantillon pour analyse NCS

A / 1 Lysat d’échantillon Totalité du lysat d’échantillon Totalité du lysat de NCS

B / 2 Solution lavage 1 600 µL de NM3 600 µL de NM3

C / 3 Solution lavage 2 600 µL de NM4 600 µL de NM4

D / 4 Solution lavage 3 600 µL d’éthanol 80% 600 µL d’éthanol 80%

E / 5 Tampon d’élution 100 µL de NM6 100 µL de NM6

6. Après distribution de ces tampons, ajouter 620 µL de solution NM2+Billes (ou 600 µL de NM2 et 20 µL de billes) pour chaque

échantillon dans le puits en position A de la barrette ou la plaque 1 (selon l’automate utilisé).

7. Positionner les peignes protecteurs des barreaux aimantés.

8. Placer les barrettes ou plaques dans l’automate.

9. Lancer le run d’extraction :

• Script NM_LSI_15prep pour l’automate KingFisher™ mL

• Script NM_LSI_RRC96 pour l’automate KingFisher™ 96/Flex

6 VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire

10. A la fin du run d’extraction :

a. Sur l’automate KingFisher™ mL : transférer les éluâts contenus en position E de la barrette d’extraction dans des microtubes

préalablement identifiés).

b. Sur l’automate KingFisher™ 96/Flex : recouvrir la plaque d’élution (plaque 5) avec un film adapté.

c. Jeter les autres consommables plastiques utilisés pour l’extraction (plaques, barrettes, peignes).

Maintenir les éluâts obtenus (plaque fermée ou microtube) entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en

dessous de −16°C.

Extraction avec le QIAamp™ DNA Mini Kit

Avant de commencer

• Reconstitution Buffer AW1 et AW2 : Ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la

première utilisation.

• Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins

négatifs).

Protocole

1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :

Liquide broncho-alvéolaire, aspiration

trans-trachéale, semences

Ecouvillons NCS

Solution de lyse 180 µL de Buffer ATL

+ 20 µL de protéinase K

180 µL de Buffer ATL

+ 20 µL de protéinase K

180 µL de Buffer ATL

+ 20 µL de protéinase K

Prise d’essai

100 µL de culot cellulaire resuspendu

ou 100 µL de semence fractionnée

200 µL d'éluât d’écouvillon 200 µL de PBS 1X

2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.

3. Incuber 30 minutes à 70°C.

4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.

5. Ajouter 200 µL de buffer AL et vortexer pendant 15 secondes.

6. Incuber 10 minutes à 70°C.

7. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.

8. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement

le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.

9. Prendre une mini-colonne du QIAamp™ DNA Mini Kit - Identifier la colonne.

10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube collecteur

- Conserver la colonne.

11. Distribuer 500 µL de buffer AW1 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube

collecteur - Conserver la colonne.

12. Distribuer 500 µL de buffer AW2 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 15000 × g - Jeter le tube

collecteur - Conserver la colonne.

13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 15000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le

tube collecteur - Conserver la colonne.

14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer AE - Boucher.

15. Incuber 1 minute à température ambiante.

16. Centrifuger 1 minute à 6000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.

Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.

VetMAX™ IBR gB Kit Guide Complémentaire 7

Extraction avec le kit NucleoSpin™ Tissue

Avant de commencer

• Reconstitution Buffer B5 : Ajouter la quantité requise d’éthanol 96–100% selon les recommandations du fournisseur avant la première

utilisation.

• Reconstitution de la protéinase K : Ajouter la quantité requise de buffer PB selon les recommandations du fournisseur avant la première

utilisation.

• Préparer et identifier le nombre de microtubes et de colonnes correspondant au nombre d’échantillon à extraire (comprenant les témoins

négatifs).

Protocole

1. Réaliser la lyse des échantillons comme décrit ci-dessous :

Liquide broncho-alvéolaire, aspiration

trans-trachéale, semences

Ecouvillons NCS

Solution de lyse 180 µL de Buffer T1

+ 25 µL de protéinase K

180 µL de Buffer T1

+ 25 µL de protéinase K

180 µL de Buffer T1

+ 25 µL de protéinase K

Prise d’essai

100 µL de culot cellulaire resuspendu

ou 100 µL de semence fractionnée

200 µL d'éluât d’écouvillon 200 µL de PBS 1X

2. Vortexer immédiatement pendant 15 secondes.

3. Incuber 30 minutes à 70°C.

4. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.

5. Ajouter 200 µL de buffer B3 et vortexer pendant 15 secondes.

6. Incuber 10 minutes à 70°C.

7. Laisser refroidir les tubes et centrifuger brièvement avant ouverture.

8. Ajouter dans chaque tube 200 µL d’éthanol 96–100% - Homogénéiser en vortexant pendant 15 secondes - Centrifuger rapidement

le tube avant ouverture. On obtient le lysat de l’échantillon.

9. Prendre une mini-colonne du kit NucleoSpin™ Tissue - Identifier la colonne.

10. Transférer la totalité du lysat de l’échantillon sur la colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur

- Conserver la colonne.

11. Distribuer 500 µL de buffer BW dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube collecteur

- Conserver la colonne.

12. Distribuer 600 µL de buffer B5 (reconstitué) dans chaque colonne - Boucher - Centrifuger 1 minute à 11000 × g - Jeter le tube

collecteur - Conserver la colonne.

13. Placer la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 mL - Centrifuger 3 minutes à 11000 × g (pour sécher la membrane) - Jeter le

tube collecteur - Conserver la colonne.

14. Placer la colonne dans un microtube de 1.5 mL - Distribuer 200 µL de buffer BE - Boucher.

15. Incuber 1 minute à température ambiante.

16. Centrifuger 1 minute à 6000 × g pour éluer - Jeter la colonne - Conserver le microtube.

Maintenir les éluâts obtenus entre 2°C et 8°C si la PCR est réalisée tout de suite ou les conserver en dessous de −16°C.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

22 décembre 2016

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

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• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

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• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs produits selon les termes et conditions générales de ventes disponibles

sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous pouvez prendre contact

avec Life Technologies à l'adresse web suivante : thermofisher.com/support.

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

SABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.

Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008781 (français)

Révision

Date

Description

B.0

22 décembre 2016

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

6 février 2014

Base de référence pour l’historique de révision

Personne morale : Life Technologies Corporation | Carlsbad, CA 92008 États-Unis | Numéro gratuit aux États-Unis 1 800 955 6288

NucleoSpin est une marque de MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. QIAamp et QIAGEN sont des marques de QIAGEN GmbH.

Thermo Fisher Scientific VetMAX IBR gB Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX IBR gB Kit

Taper: Mode d'emploi

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