Thermo Fisher Scientific VetMAX C. fetus Kit Mode d'emploi

Marque: Thermo Fisher Scientific

Modèle: VetMAX C. fetus Kit

Taper: Mode d'emploi

Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.

NOTICE D’UTILISATION

VetMAX™ C. fetus Kit

PCR temps réel TaqMan® pour la détection de Campylobacter fetus

Référence Catalogue CFP50

Partie Nº 100020352 Pub. Nº MAN0008723 Rév. B.0

Technique Espèce(s) Acides nucléiques isolés à partir des matrices Test

PCR temps réel (ADN)

– Duplex

– IPC endogène

Bovins

Mucus vaginal et cervico-vaginal

Secrétions ou mucus du prépuce

Semences

Placenta

Avortons (liquide stomacal, foie, liquide poumon)

Individuel

AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes

de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse

thermofisher.com/support.

AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques

du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.

Informations sur le produit

Description du produit

Applied Biosystems™ VetMAX™ C. fetus Kit est un outil de diagnostic moléculaire permettant la détection par PCR temps réel de

Campylobacter fetus.

Chaque échantillon d’ADN obtenu après extraction est analysé en monocupule : la même cupule est utilisée pour la détection spécifique

de l’ADN bactérien de Campylobacter fetus et pour la détection d’un IPC (Internal Positive Control). La positivité de l’IPC traduit à la fois

l’efficacité de l’extraction et l’absence d’inhibiteur dans les échantillons.

Il est utilisable sur ADN bactériens extraits à partir de placenta, mucus vaginal et cervico-vaginal, de secrétions ou mucus du prépuce, de

semences, de placenta ou d’avortons (liquide stomacal, foie, liquide poumon).

Les protocoles complets d’extractions des ADN bactériens à partir de ces matrices sont disponibles sur demande au Support Technique.

Réactifs du kit et conservation

Le VetMAX™ C. fetus Kit se présente sous la forme d’un coffret contenant les différents réactifs pour la détection en duplex de

Campylobacter fetus et d’un contrôle interne IPC. À réception, le kit doit être conservé dans sa totalité entre −30°C et −10°C. Après

première utilisation d’un composant, le conserver selon les recommandations suivantes :

Article Description Volume

(50 réactions)

Conservation

A réception Après première

utilisation

3 - Mix C. fetus

(Tube vert)

Mix pour PCR TaqMan®. Contient :

• Le système de détection pour la cible C. fetus, comprenant une sonde

TaqMan® marquée FAM™ - NFQ (Non-Fluorescent Quencher).

• Le système de détection pour l’IPC, comprenant une sonde TaqMan®

marquée VIC™ - NFQ (Non-Fluorescent Quencher).

• Le tampon et l’enzyme de PCR temps réel.

2 × 500 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

4a - EPC C. fetus

(Tube marron)

External Positive Control :

Contrôle positif en C. fetus. Il s’agit d’acides nucléiques déjà extraits à

amplifier lors de la PCR temps réel.

90 µL −30°C à −10°C −30°C à −10°C

Témoins d’extraction et d’amplification

Le VetMAX™ C. fetus Kit contient 1 témoin permettant la validation de l’amplification des ADN bactériens :

4a - EPC C. fetus : contrôle positif en Campylobacter fetus

Contrôle positif déjà extrait à amplifier lors de la PCR temps réel.

Un résultat positif compris dans l’intervalle accepté de Ct permet de valider l’amplification de la cible Campylobacter fetus par PCR

temps réel.

2 VetMAX™ C. fetus Kit Notice d’Utilisation

La validation de l’extraction des acides nucléiques pour chaque échantillon s’effectue grâce à la détection d’un IPC endogène (Internal

Positive Control), présent dans chaque échantillon.

Un résultat IPC positif avec une valeur conforme dans un échantillon permet de valider l’extraction de cet échantillon qu’il soit positif

ou négatif pour le pathogène recherché : élimination des faux négatifs et vérification de l’effet des inhibiteurs.

Il est recommandé de réaliser deux contrôles négatifs pour valider le bon déroulement de l’analyse :

NCS : contrôle négatif d’extraction

C’est un témoin composé des réactifs utilisés lors de l’extraction, sans ajout d’échantillon (le volume d’échantillon peut être remplacé

par le tampon utilisé lors de la préparation des échantillons ou par de l’eau DNase/RNase-free), qui subit le même traitement que les

échantillons : extraction des acides nucléiques puis PCR temps réel.

Un résultat négatif en Campylobacter fetus et en IPC endogène permet de valider l’absence de contamination au cours de l’extraction et

de la PCR temps réel.

NC : contrôle négatif d’amplification

Il s’agit du mix d’amplification déposé dans la plaque au moment de la préparation de la PCR temps réel, complété de 5 µL d’eau

DNase/RNase-free pour ajuster la réaction à 25 µL.

Un résultat négatif pour Campylobacter fetus et IPC permet de valider l’absence de contamination au cours de la préparation des

réactions pour la PCR temps réel.

Matériel et réactifs requis pour la PCR temps réel non fournis dans le kit

Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com.

• Micropipettes de précision (gamme de 1 µL à 1000 µL) avec pointes DNase/RNase-free à filtre

• Eau DNase/RNase-free

• Tampon TE 1X

• Tampon PBS 1X

• Un thermocycleur de PCR temps réel capable de détecter les fluorophores suivants :

– FAM™ (maximum d’émission : λ515 nm)

– VIC™ (maximum d’émission : λ554 nm)

• Consommables de qualité optique compatibles avec le thermocycleur utilisé :

– Plaques PCR 96 puits, barrettes PCR (8 ou 12 puits), microtubes ou capillaires

– Films ou bouchons adaptés à la fermeture

Procédure d’analyse

Le volume réactionnel de la PCR temps réel est de 25 µL :

• 3 - Mix C. fetus : 20 µL par analyse

• ADN extrait : 5 µL par analyse

Extraction des ADN bactériens

Il est nécessaire d’isoler les ADN à partir des échantillons pour l’analyse par PCR temps réel.

NOTE : Pour connaître des méthodes d’extractions compatibles et validées avec le VetMAX™ C. fetus Kit, merci de contacter le Support

Technique.

Préparation de la PCR temps réel

1. Créer un plan d’analyse pour la distribution des mix et échantillons. Éloigner si possible le contrôle positif (EPC) des autres

échantillons.

2. Décongeler le tube 3 - Mix C. fetus entre 2°C et 8°C, sur glace ou sur un portoir réfrigérant.

3. Homogénéiser le tube 3 - Mix C. fetus par agitation douce, puis centrifuger brièvement.

4. Distribuer 20 µL de 3 - Mix C. fetus par puits de la plaque PCR, barrette PCR ou capillaire utilisé.

5. Ajouter les ADN des échantillons et contrôles au mix réactionnel, selon le plan d’analyse prédéfini :

Type d’analyse

Composant Volume d’échantillon

Echantillon pour analyse

ADN extraits de l’échantillon 5 µL

Contrôle positif d’amplification

4a - EPC C. fetus 5 µL

Contrôle négatif d’extraction (NCS)

NCS extrait 5 µL

Contrôle négatif d’amplification (NC)

Eau DNase/RNase-free 5 µL

6. Fermer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires avec un film adhésif ou des bouchons adaptés.

VetMAX™ C. fetus Kit Notice d’Utilisation 3

Amplification par PCR en temps réel

1. Créer les détecteurs suivants sur le thermocycleur :

Reporter Quencher

CFP

FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

IPC CFP

VIC™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)

Référence passive : ROX

™(1)

(1) Le fluorophore ROX™ est à renseigner obligatoirement pour l’analyse par PCR temps réel si le thermocycleur est capable de le détecter. Pour les autres

thermocycleurs, l’absence de détection de ce fluorophore ne remet pas en cause l’analyse par PCR temps réel.

2. Attribuer pour chaque échantillon le détecteur CFP et le détecteur IPC CFP dans le puits utilisé pour l’analyse.

3. Créer le programme de PCR temps réel suivant pour l’analyse :

Répétitions de l’étape Température Durée

Etape 1

×1 50°C 2 minutes

Etape 2

×1 95°C 10 minutes

Etape 3 ×45 95°C 15 secondes

60°C(1) 1 minute

(1) Collecte des données de fluorescence durant la phase 60°C – 1 minute.

4. Placer la plaque PCR, les barrettes PCR ou les capillaires dans le thermocycleur et démarrer la PCR temps réel.

Analyse des résultats

Analyse des données brutes

Se référer aux recommandations du fournisseur du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.

1. Placer les lignes seuils (threshold) de manière indépendante pour chaque cible de la PCR temps réel.

2. Interpréter les résultats en fonction des valeurs de Ct obtenues pour les échantillons pour chaque détecteur selon les recommandations

ci-après.

Validation du test

La validation du test passe par l’acceptation des critères suivants :

Détecteur CFP Détecteur IPC CFP Validation

EPC C. fetus

Ct = Ct QC CFP de 4a - EPC C. fetus ± 3Ct(1) Ct < 45 ou Ct > 45(2) PCR validée

NCS

Ct > 45 Ct > 45 Extraction validée

Ct > 45 Ct > 45 Réactifs PCR validés

(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe 2.1 « EPC » du Certificat d’Analyse du lot utilisé pour l’essai.

(2) Ne pas prendre en compte la valeur d’IPC dans l’EPC pour la validation du test.

Interprétation des résultats

Pour chaque échantillon analysé, interpréter les résultats comme décrit ci-dessous :

Détecteur CFP

Détecteur IPC CFP Interprétation

< 45

Ct < 45 ou Ct > 45 C. fetus détecté

> 45

Ct < 45 C. fetus non détecté

> 45

Ct > 45 Non validé(1)

(1) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la négativité de l’IPC.

Conduite à tenir pour les échantillons non validés

1. Diluer l’ADN de l’échantillon non validé au 1:10 en tampon TE 1X.

2. Faire une nouvelle analyse PCR sur 5 µL de cette dilution.

3. Si l’ADN dilué est positif en C. fetus ou négatif en C. fetus avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.

4. Si l’ADN dilué est négatif en C. fetus avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non validé. Dans ce cas,

renouveler l’extraction de l’échantillon en le pré-diluant au 1:10 dans du tampon PBS 1X avant extraction.

5. Si le résultat est toujours non validé, répéter l’analyse sur un nouveau prélèvement.

thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion

thermofisher.com

29 juin 2017

Documentation et support

Service clientèle et assistance technique

Support technique : rendez-vous sur

thermofisher.com/askaquestion

Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux

dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance

technique, notamment :

• Numéros de téléphone partout dans le monde

• Commande et Support web

• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles

• Certificats d’analyse

• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également

appelées FS (Fiches Signalétiques))

Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux

produits chimiques d'autres fabricants, contacter

chaque fabricant.

Garantie produit limitée

Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs

produits selon les termes et conditions générales de ventes

disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/

global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous

pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web

suivante : thermofisher.com/support.

Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois Dieu | 69380 Lissieu, France

Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.

CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-

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Historique des révisions : Pub. Nº MAN0008723 (français)

Révision

Date

Description

B.0

29 juin 2017

Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.

A.0

25 novembre 2013

Base de référence pour l’historique de révision

Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de

diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.

TaqMan est une marque dé posée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.