Thermo Fisher Scientific VetMAX Neospora caninum Mode d'emploi

Marque
Thermo Fisher Scientific
Modèle
VetMAX Neospora caninum
Catégorie
Testeurs de réseau câblé
Taper
Mode d'emploi
Réservé à l’usage vétérinaire. Usage in vitro exclusivement.
NOTICE D’UTILISATION
VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit
PCR temps-réel TaqMan® pour la détection de
Neospora caninum
Référence Catalogue NEOSP
Partie Nº 100032697 Pub. Nº MAN0011151 Rév. B.0
Technique
Espèces
Échantillons
Test
Real-time PCR (ADN)
– Duplex
– IPC exogène
Bovins
Petits ruminants
(ovins, caprins)
Tissus
(encéphale, muscle cardiaque, tissus d’avortement) Individuel
AVERTISSEMENT ! Lire les fiches de données de sécurité (FDS) et suivre les consignes de manipulation. Porter des lunettes
de sécurité, des gants et des vêtements appropriés. Les fiches de données de sécurité (FDS) sont disponibles à l’adresse
thermofisher.com/support.
AVERTISSEMENT ! RISQUES BIOLOGIQUES POTENTIELS. Lire les informations de sécurité relatives aux risques biologiques
du produit disponibles sur thermofisher.com. Porter des lunettes de sécurité, des gants et des vêtements appropriés.
Description du produit
Applied Biosystems™ VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit (Réf. NEOSP) permet la détection de Neospora caninum dans les
tissus des ruminants par l’amplification par PCR en temps réel du gène Neospora Nc5.
Le kit contient les réactifs nécessaires à la PCR temps réel monocupule dans laquelle les cibles Neospora et le contrôle positif interne
(IPC) exogène sont amplifiés et détectés à l’aide de sondes fluorescentes TaqMan®. Le kit comprend :
• 3 - Mix Neospora : master mix optimisé pour l'amplification par PCR en temps réel en duplex de la cible Neospora et d'un contrôle positif
interne. Il contient des primers, des sondes TaqMan®, un tampon PCR et une enzyme.
• 4a - EPC Neospora : acide nucléique pour la cible Nc5. Il sert de contrôle positif externe pour les composants de la PCR en temps réel et est
utilisé pour définir le cycle seuil (Ct) afin d’évaluer les résultats des tests.
• 5 - IPC : contrôle positif interne ajouté à chaque échantillon et contrôle lors de l'étape de lyse de l’extraction de l’ADN. Il sert de contrôle
pour le processus de purification de l’ADN et permet de surveiller la présence d’inhibiteurs PCR.
Contenu du kit et conditions de conservation
Des réactifs pour 50 réactions de PCR en temps réel (25 µL) sont fournis.
Composant Volume
(50 réactions)
Conservation
3 - Mix Neospora 2 × 500 µL −30°C à −10°C
4a - EPC Neospora 1 × 90 µL −30°C à −10°C
5 - IPC(1) 1 × 250 µL −30°C à −10°C
(1) Destiné à l’utilisation exclusive avec le VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit.
2 VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit Notice d’Utilisation
Matériel requis mais non fourni
Sauf indication contraire, tous les produits sont disponibles sur thermofisher.com. PFL : Fisher Scientific (fisherscientific.com) ou l’un
des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire.
Élément Source
Instrument et équipement
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System ou équivalent Contacter votre représentant commercial
Pipettes Nuclease-free PFL
• Un pour la zone de configuration de la PCR dans laquelle le mix PCR est préparé
PFL
Support de plaques de précision pour le 7500 Real-Time PCR System, selon votre essai
Pour les plaques A24820
4367033
Plaques de réactions optiques et couvercles ou tubes de PCR optiques et bouchons, selon votre essai
™
4316813
™
4311971
MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2 mL 4316567
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips 4323032
Réactifs
Eau Nuclease-free AM12450
PFL
Autres consommables
Tubes de réactifs Nuclease-free pour préparer le master mix PFL
PFL
Importantes directives de procédure
• Pour chaque test de PCR en temps réel, inclure les contrôles indiqués à l’étape 1.
• Décongeler les réactifs d’amplification dans un seau à glace ou portoir réfrigéré et les contrôles et échantillons dans un seau à glace ou un
portoir réfrigéré séparé.
• Maintenir les réactifs, contrôles et échantillons décongelés à une température fraiche (2–8ºC).
• Bien mélanger le contenu de chaque tube en le vortexant, puis centrifuger brièvement avant utilisation.
• Suivre les « Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR » à la page 4 afin d’empêcher les faux positifs et la contamination des prises
d’essai par les produits PCR.
Exigences relatives à l’ADN introduit
L’essai est réalisé sur de l’ADN extrait à partir de 20 mg de tissu. Les méthodes d’extraction de l’ADN validées pour une utilisation
avec le VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit sont fournies sur demande par l’assistance technique. De plus, préparer un
échantillon contrôle sans matrice avec de l’eau Nuclease-free (contrôle d’extraction). Utiliser la même méthode d'extraction d'ADN que
pour les échantillons à tester.
IMPORTANT! Ajouter 5 µL de 5 - IPC à la solution de lyse utilisée pour l’isolation d’ADN pour chaque échantillon et contrôle
d’extraction.
Effectuer une PCR en temps réel
Configurer les réactions de PCR en temps réel
1. Répartir 20 µL de 3 - Mix Neospora sur le nombre approprié de puits de plaques PCR ou de tubes de barrettes.
2. Ajouter l’échantillon ou le contrôle conformément au tableau suivant :
Type d’échantillon Composant Volume par réaction
Échantillon à tester Échantillon d’ADN 5.0 µL
Contrôle positif
4a - EPC Neospora
5.0 µL
Contrôle d’extraction
Contrôle d'extraction purifié
5.0 µL
Contrôle sans matrice Eau Nuclease-free 5.0 µL
3. Sceller chaque puits de réaction.
VetMAX™ Neospora caninum Detection Kit Notice d’Utilisation 3
Configurer et lancer l’instrument PCR en temps réel
1. En suivant les instructions du fabricant, configurer le test de PCR en temps réel à l’aide des paramètres suivants.
• Volume réactionnel : 25 µL
• Référence passive : ROX™ (inclus dans le 3 - Mix Neospora).
Remarque : Le ROX™ est à renseigner obligatoirement si le thermocycleur est capable de le détecter. Les thermocycleurs qui
ne détectent pas le ROX™ peuvent être utilisés sans affecter l’exactitude de la lecture.
• Sélectionner des détecteurs et attribuer des détecteurs TaqMan® pour chaque puits ou tube utilisé pour l’analyse :
Cible Reporter Quencher
Neospora FAM™ NFQ (Non-Fluorescent Quencher)
IPC
VIC
™
TAMRA
™(1)
(1) Le TAMRA™ est à renseigner obligatoirement pour l’analyse PCR en temps réel si le thermocycleur est capable de le détecter. Les
thermocycleurs qui ne détectent pas le TAMRA™ peuvent être utilisés sans affecter l’exactitude de la lecture.
• Paramètres du thermocycleur :
Phase Répétitions Température Durée
1
1×
50ºC
2 minutes
2 1× 95ºC 10 minutes
3 45× 95ºC 15 secondes
60ºC
1 minute
2. Lancer le programme du thermocycleur et collecter les données d’amplification en temps réel durant l’étape d’élongation
(1 minute à 60 °C).
Analyse des données
Se référer aux recommandations du fabricant du thermocycleur pour l’analyse des données brutes.
1. Régler les seuils individuellement pour chaque cible de PCR en temps réel.
2. Interpréter les résultats de chaque contrôle et échantillon en fonction des valeurs Ct obtenues comme indiqué dans les
paragraphes suivants.
Validation
Se référer aux valeurs Ct QC dont la liste figure dans le Certificat d’Analyse du lot utilisé pour le test. Le test est validé si les critères
suivants sont acceptés :
Réaction du contrôle
Détecteur Neospora
(FAM
™
)
Détecteur IPC
(VIC
™
)
Interprétation
Contrôle positif
C
t
= C
t QC
Neospora
± 3C
t(1)
N’importe quelle valeur
(2)
PCR validées
Contrôle d’extraction(3) Ct > 45 Ct = Ct QC IPC ± 3Ct(4) Extraction validée
Contrôle sans matrice Ct > 45 Ct > 45 Réactifs PCR validés
(1) Se référer aux valeurs indiquées dans le paragraphe « Résultats de contrôle qualité – EPC » du Certificat d'Analyse.
(2) La valeur d’IPC dans le contrôle positif n’est pas à prendre en compte pour la validation du test.
(3) Utiliser le contrôle d’extraction préparé dans la même procédure d’extraction que celle utilisée pour les échantillons.
(4) Se référer à la valeur indiquée dans le paragraphe « Résultats de contrôle qualité – IPC » du Certificat d'Analyse.
Interprétation des résultats
Cible
Neospora
(FAM™)
Détecteur IPC
(VIC™) Interprétation
C
t
< 45
N’importe quelle valeur
Neospora caninum
détecté
C
t
> 45
C
t
= C
t
du contrôle d’extraction ±3C
t(1)
Neospora caninum non détecté
Ct > 45 Ct est en dehors de cette plage : Ct du contrôle d’extraction ±3 Ct(1) Non validé(2)
(1) La valeur Ct du contrôle d’extraction doit d’abord être validée comme décrit dans le paragraphe « Validation ».
(2) L’échantillon sera rendu comme non validé en raison de la valeur non conforme de l’IPC.
Conduite à tenir pour les échantillons non validés
1. Diluer l’ADN des échantillons non validés au 1:10 en tampon TE 1X.
2. Effectuer une analyse de PCR en temps réel avec 5 µL de cette dilution.
3. Si l’ADN dilué est positif ou négatif en Neospora avec un résultat IPC conforme, le résultat obtenu est alors validé.
4. Si l’ADN dilué est négatif en Neospora avec un résultat IPC non conforme, le résultat obtenu est toujours non valide. Dans ce cas,
répéter l’analyse sur un nouvel échantillon.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
7 août 2018
Bonnes pratiques de laboratoire pour la PCR
Lors de la préparation d’échantillons pour l’amplification PCR :
• Porter des gants et une blouse de laboratoire propres (qui n’ont pas été portés précédemment lors de la manipulation de produits
amplifiés ou pendant la préparation d’autres échantillons).
• Changer systématiquement de gants en cas de doutes quant à leur contamination possible.
• Maintenir des zones distinctes ainsi que des équipements et des consommables dédiés pour les tâches suivantes :
• Préparation des échantillons et configuration de la réaction
• Amplification et analyse des produits
• Ne pas introduire les produits amplifiés dans la zone de configuration de la réaction.
• Ouvrir et fermer tous les tubes d’échantillon avec soin. Éviter toute projection et émanation d’échantillons.
• Maintenir les composants et réactifs bouchés dans la mesure du possible.
• Utiliser une micropipette à piston ou des embouts de pipette résistant aux aérosols.
• Nettoyer les paillasses et l’équipement de laboratoire de manière périodique avec une solution d’eau de Javel à 10 % ou DNAZap™
Solutions (Réf. AM9890).
Documentation et support
Service clientèle et assistance technique
Support technique : rendez-vous sur
thermofisher.com/askaquestion
Visiter thermofisher.com/support pour avoir accès aux
dernières nouveautés relatives aux services et à l'assistance
technique, notamment :
• Numéros de téléphone partout dans le monde
• Commande et Support web
• Guides de l’utilisateur, manuels et protocoles
• Certificats d’analyse
• Fiches de Données de Sécurité (FDS, également
appelées FS (Fiches Signalétiques))
Remarque : Pour les FDS relatives aux réactifs et aux
produits chimiques d'autres fabricants, contacter chaque
fabricant.
Garantie produit limitée
Life Technologies Corporation et ses filiales garantissent leurs
produits selon les termes et conditions générales de ventes
disponibles sur le site www.thermofisher.com/us/en/home/
global/terms-and-conditions. Si vous avez des questions, vous
pouvez prendre contact avec Life Technologies à l'adresse web
suivante : thermofisher.com/support.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Écureuils | Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu, France
Traduit de l’anglaise Pub. Nº MAN0010879 Rév. B.0.
Les informations contenues dans ce guide sont susceptibles d’être modifiées sans préavis.
CLAUSE DE NON-RESPONSABILITÉ : DANS LA MESURE PERMISE PAR LA LOI, LIFE TECHNOLOGIES ET/OU SA OU SES FILIALE(S) NE SAURAIENT ÊTRE TENUES RESPON-
SABLES DE DOMMAGES SPÉCIAUX, ACCESSOIRES, INDIRECTS, PUNITIFS, MULTIPLES OU CONSÉCUTIFS LIÉS AU PRÉSENT DOCUMENT OU A SON USAGE OU EN RÉSULTANT.
Historique des révisions : Pub. Nº MAN0011151 (français)
Révision
Date
Description
B.0
7 août 2018
Mise à jour sur le modèle du document en cours, avec mises à jour associées à la garantie, aux marques et aux logos.
A.0
7 avril 2015
Nouveau document.
Licence à Usage Limité Nº 460 : Diagnostic vétérinaire PCR. Avis aux acheteurs : destiné à des services de diagnostic vétérinaire, notamment l’établissement de rapports de
diagnostic payants et pour les besoins de la recherche uniquement. Le diagnostic chez l’homme nécessite une licence séparée de Roche.
©2018 Thermo Fisher Scientific Inc. Tous droits réservés. Toutes les marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific et de ses filiales, sauf indication contraire.
TaqMan est une marque déposée de Roche, utilisée sous autorisation et licence.
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Thermo Fisher Scientific VetMAX Neospora caninum Mode d'emploi

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